实验二植物胚性愈伤组织诱导、胚状体的分化与高再生能力基因型的筛选

实验二实验二 植物胚性愈伤组织诱导、胚状植物胚性愈伤组织诱导、胚状体的分化与高再生能力基因型的筛选体的分化与高再生能力基因型的筛选实验目的实验目的l理解植物细胞全能性的概念及应用。理解植物细胞全能性的概念及应用。l了解并掌握植物体细胞胚胎发生的过程和途径。了解并掌握植物体细胞胚胎发生的过程和途径。l了解植物体细胞胚胎发生的影响因素。了解植物体细胞胚胎发生的影响因素。l了解紫花苜蓿高胚状体发生基因型筛选的原理了解紫花苜蓿高胚状体发生基因型筛选的原理与方法。与方法。实验原理实验原理l植物细胞全能性植物细胞全能性(totipotent(totipotent)：在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导产在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导产生器官生器官分化分化和和再生再生，成为具有与母体植株，成为具有与母体植株相同相同遗传信息遗传信息的植株的能力。的植株的能力。l植物细胞全能性的相对性植物细胞全能性的相对性1.不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；有良好的培养反应；2.动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异。动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异。3.细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。生植物个体。细胞脱分化细胞脱分化（dedifferentiation)是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生组织状态，或细胞分工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。胚性细胞状态。l 离体条件下植物细胞的脱分化和再分化离体条件下植物细胞的脱分化和再分化l愈伤组织愈伤组织(calluscallus)：脱分化后的细胞，往往：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团。散的薄壁细胞团。草莓草莓烟草烟草l细胞再分化（细胞再分化（redifferentiationredifferentiation)：l脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，成单极性的芽或根，或或经历胚胎发生形成双极性经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。l极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。立的标志。细胞全能性细胞全能性脱分化脱分化再分化再分化个体再生个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。达的最终体现。细胞分裂细胞分裂细胞全能性与脱分化和再分化的关系细胞全能性与脱分化和再分化的关系植株再生两种途径：两种途径：l器官发生途径器官发生途径:根芽器官直接分化形成植株根芽器官直接分化形成植株l体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径:产生具有胚芽、胚根的胚状体结构再形成产生具有胚芽、胚根的胚状体结构再形成植株植株器官发生植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious rootsadventitious roots）、不定芽）、不定芽（adventitious shootsadventitious shoots）等器官的过程。）等器官的过程。通过器官发生形成再生植株有三种方式：通过器官发生形成再生植株有三种方式：先芽后根先芽后根ABCD百脉根百脉根先根后芽先根后芽在愈伤组织的不同部位形成芽在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过和根，再通过维管组织维管组织的联系的联系形成完整植株。形成完整植株。植物体细胞胚胎发生植物体细胞胚胎发生l胚状体：（胚状体：（embryoid）亦称体细胞胚或体胚。）亦称体细胞胚或体胚。在体外，由体细胞（非合子细胞）经胚胎发育在体外，由体细胞（非合子细胞）经胚胎发育产生的类似胚胎的结构。产生的类似胚胎的结构。l其发育过程与合子胚类似，经过原胚、球形胚、其发育过程与合子胚类似，经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段。心形胚、鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段。植物体细胞胚胎发生植物体细胞胚胎发生l在其发生的最早阶段就具有两极性，即根端在其发生的最早阶段就具有两极性，即根端（胚根）和茎端（胚芽），并且与母体细胞或（胚根）和茎端（胚芽），并且与母体细胞或外植体的维管束无直接联系外植体的维管束无直接联系l胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养。取得营养。l很容易从愈伤组织的表面脱离下来，在适宜条很容易从愈伤组织的表面脱离下来，在适宜条件下长成一株植物。件下长成一株植物。类似于动物胚胎早期的发育类似于动物胚胎早期的发育胚胎细胞发胚胎细胞发生生发育早期发育早期2 2次均等分裂次均等分裂胚结构形胚结构形成成体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种：地发生，大致分为五种：l直接从器官外植体上发生直接从器官外植体上发生(以叶片为例）以叶片为例）l愈伤组织发生愈伤组织发生l悬浮培养细胞发生悬浮培养细胞发生l单倍体细胞发生单倍体细胞发生l原生质体发生原生质体发生体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径1 1：叶片叶片诱导阶段诱导阶段胚胎发育阶段胚胎发育阶段(兰草兰草,Chen,Chen等等,1999),1999)兰草兰草体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径2：愈伤组织愈伤组织悬浮细胞体细胞胚发生过程悬浮细胞体细胞胚发生过程愈伤组织愈伤组织胚性愈伤组织胚性愈伤组织悬浮培养的悬浮培养的胚性细胞团胚性细胞团球形胚形成球形胚形成成熟子叶胚成熟子叶胚影响因子影响因子外因外因内因内因遗传性状遗传性状生理状态生理状态营养条件营养条件环境条件环境条件无机盐无机盐有机物有机物激素激素天然复合物天然复合物渗透压渗透压酸碱度酸碱度湿度湿度温度温度光照光照影响体细胞胚影响体细胞胚发生的因素发生的因素高胚状体发生基因型筛选的原理：高胚状体发生基因型筛选的原理：l紫花苜蓿：异花授粉（虫媒花），紫花苜蓿：异花授粉（虫媒花），2n=32从理论上讲每一个植株为一个基因型，将每一个从理论上讲每一个植株为一个基因型，将每一个植物的外植体分别培养，比较分析胚状体发生植物的外植体分别培养，比较分析胚状体发生数目的差异，从中可挑选出胚状体发生能力高数目的差异，从中可挑选出胚状体发生能力高的基因型。的基因型。实验材料与用品实验材料与用品l材料：烟草、百脉根材料：烟草、百脉根l用品：接种器械用品：接种器械、超净工作台、等、超净工作台、等l培养基：添加不同有机物的培养基，重点观察培养基：添加不同有机物的培养基，重点观察有机物对胚状体形成的影响，观察不同外植体有机物对胚状体形成的影响，观察不同外植体上胚状体的形成。上胚状体的形成。实验步骤：实验步骤：l愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导取无菌苗下胚轴或子叶为外植体（切成取无菌苗下胚轴或子叶为外植体（切成3-5mm），每瓶分两部分，每部分放一个植株），每瓶分两部分，每部分放一个植株来源的外植体，封口，培养。来源的外植体，封口，培养。培养条件：光周期培养条件：光周期16h/8h，光照强度，光照强度3000lux，温度温度25-28.观察：观察：3-7d3-7d时观察不同有机物的培养基中愈伤时观察不同有机物的培养基中愈伤组织启动的差异；组织启动的差异；21-28d21-28d时观察每种培养基上时观察每种培养基上外植体形成胚状体的差异和相同培养基上不同外植体形成胚状体的差异和相同培养基上不同基因型植株形成胚状体的差异。基因型植株形成胚状体的差异。l胚状体分化与高胚状体发生基因型的筛选胚状体分化与高胚状体发生基因型的筛选将不同植株上形成的胚状体转移到新鲜的将不同植株上形成的胚状体转移到新鲜的l 21-28d后观察胚状体分化状况后观察胚状体分化状况挑选高胚状体发生基因型，取分化成苗的基因型挑选高胚状体发生基因型，取分化成苗的基因型的叶柄转入新鲜的愈伤组织分化培养基中进行的叶柄转入新鲜的愈伤组织分化培养基中进行新一轮的选择。新一轮的选择。未生根的植株转入生根培养基中生根。未生根的植株转入生根培养基中生根。实验步骤：实验步骤：实验结果与分析实验结果与分析l一些重要实验现象可用数码相机照相，存入电一些重要实验现象可用数码相机照相，存入电脑，保存电子照片。脑，保存电子照片。1、材料培养过程中实验现象的观察纪录、材料培养过程中实验现象的观察纪录培养材培养材料料培养基培养基配方配方生长状态生长状态7d14 d21d28 d百百脉脉根根（烟草）（烟草）2、不同有机物添加对胚状体发生影、不同有机物添加对胚状体发生影响响培养基培养基外植体数外植体数 分化数分化数 愈伤组织愈伤组织 胚状体数胚状体数 平均胚平均胚 最高胚最高胚 发生率发生率 状体数状体数 状体数状体数3、不同基因型形成胚状体的数目统、不同基因型形成胚状体的数目统计计编号编号下胚轴下胚轴子叶子叶123.讨论讨论l体细胞胚与合子胚的异同。体细胞胚与合子胚的异同。l影响体细胞胚发生的因素有哪些。影响体细胞胚发生的因素有哪些。l一些传统中草药材不同植株间的药性成分有很一些传统中草药材不同植株间的药性成分有很大差异，本实验思路对挑选高药性成分的基因大差异，本实验思路对挑选高药性成分的基因型是否有帮助，请你提出你的实验设计。型是否有帮助，请你提出你的实验设计。