荧光显微镜及其操作

荧光显微镜（Fluorescence microscope）及其操作某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发 态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来， 由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光 部就是荧光（fluorescence）。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出 的比照射光波长更长的可见光。由此可见，被照射物质产生荧光必须具备以下两个条件：物质分子（或所特 异性结合的荧光染料）必须具有可吸收能量的生色团；该物质还必须具有一定的量子产率和适宜的环境（如 溶剂、pH、温度等）。荧光显微术是利用荧光显微镜结可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。某些物质 在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出 比照射光波长更长的光（如见光），这种光就称为荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接产生荧光，称 为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不能产生荧光， 但它吸收荧光染料后同样却能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后便可发 出桔红色荧光。荧光显微镜具特殊光源（多为紫外光光源），提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发 出荧光。在视场中所所观察到的图像，主要是样品的荧光映像。（一）光源现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时 由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达5070个标准大气压力， 这一过程一般约需515min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的 结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V）， 启动后，维持工作电压一般为5060V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h 的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此， 使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点 燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫 外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发 光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h以上，价 格也比较低。我国研制的一种简易轻便型高色温漠钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直 流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。（二）滤色系统滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板 一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott） BG12,就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母 表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24, Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个 字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm 以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国Corning厂的NO： 5-58,即相当于BG12。1 .激发滤板 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为 UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。紫蓝光激发滤板：它可使350490nm的光通过。常用型号为QB24 （BG12）。最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。近年开始采用金属膜干涉滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz 厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板，均远比玻璃滤板效果好。激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明 亮的荧光和最好的背景为准。2. 压制滤板压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应，常 用以下3种压制滤板：紫外光压制滤板:可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或 OG-1K530O紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490， K510O（三）反光镜反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射 只有70%； 一般使用平面反光镜。（四）聚光镜专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚 光器两种。还有相差荧光聚光器。1. 明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、 中倍放大的标本观察。2. 暗视野聚光器 暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除 散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外 光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高 了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。3. 相差荧光聚光器 相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光 图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。（五）物镜各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由 于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图 像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜 口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4x,5x，6.3x等）。（六）目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5x和6.3xo过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上， 但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。（七）落射光装置新型的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后，波长短的部分（紫外和紫蓝）由于滤镜上镀膜的 性质而反射，当滤镜对向光源呈45。倾斜时，则垂直射向物镜，经物镜射向标本，使标本受到激发，这时物镜 直接起聚光器的作用。同时，滤长长的部分（绿、黄、红等），对滤镜是可透的，因此，不向物镜方向反射， 滤镜起了激发滤板作用，由于标本的荧光处在可见光长波区，可透过滤镜而到达目镜观察，荧光图像的亮度随 着放大倍数增大而提高，在高放大时比透射光源强。它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明 标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置，称 之为落射荧光显微镜。荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片载玻片厚度应在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。 载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。(二) 盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干 层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这 种反射的激发光女可激发标本。(三) 标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激 发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。(四) 封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。所以， 常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。(五) 镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘 油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。使用荧光显微镜的注意事项(1) 严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。(2) 应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后， 眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。(3) 防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。(4) 检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外 线照射35min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过23h。(5) 荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温， 新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点 燃光源。(6) 标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4C保存，可延缓 荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。(7) 荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”一无或可见微弱荧光。“+” 一仅能见明确可见的荧光。“+”一 可见有明亮的荧光。+”一可见耀眼的荧光。荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须 将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。 随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。 但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与 普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作 用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图 像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。荧光染料的使用吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧 光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。EB:染色DNA和RNA荧光素双醋酸酯(FDA)： FAD本身无荧光,无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶 分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的 原生质体不能分解FAD无荧光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4C下贮存，使用 时取0.22mlFDA贮存液 加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。荧光染料HO33342和若丹明123:活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜， 只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞 不产生毒性作用。荧光染料HO33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结 合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时 染色。荧光组化实验中应注意的几个问题1 .每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有 所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2. 一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3. 在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波 长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4. 一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随 荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所 致。体视荧光显微镜使用方法与注意事项使用方法：(1) 将材料片放在载物台上。(2) 开启荧光显微镜稳压器.然后按下启动组点燃紫外灯15min内不得关闭，关闭后3min内不得再启动。(3) 将激发滤光片转至v,分色片调到v,选用495或475nm阻挡滤光片。(4) 选用uvFL40、UVFL100荧光接物镜镜检。(5) 在玻片上加无荧光油，先用40 X，再用100 x调焦镜检.呈现荧光。(7) 因荧光物质受紫外光照射时随时间的增长荧光逐渐变弱，因此镜检时应经常变换视野。(8) 亦可用UVFL10或UVFL20低倍镜镜检材料(用低倍镜时不加无荧光油)。荧光显微镜操作程序1. 开机：1.1. 打开房间总电源开关1.2. 打开电脑电源开关1.3. 打开数码相机电源开关1.4. 打开显微镜电源开关(打开汞灯电源开关)2. 调试显微镜光路：2.1, 把载玻片放到载物台上。调节聚焦。2.2, 根据物镜指数乘0.8确定聚光镜光圈值，调整到位。2.3. 将视场光阑缩小，然后调节聚光镜高度，直到从目镜中观察到视场光阑的清晰成像。2.4. 放大视场光阑，使其在目镜中的黑框扩展到视野以外。3. 调试数码相机拍摄照片：3.1. 在显微镜取景器中对好视野及焦距。3.2. 打开 photoshop 程序。3.3. 点击“文件-自动。”调出相机控制窗口。3.4. ZOOM定为77。拍摄图片格式为640*480。3.5. 在相机控制窗口上点preview，观察预览图象的亮度。选择适当的曝光时间使预览图片的亮度合适。3.6 点拍摄按纽拍摄，等待几秒钟后图片传回电脑并在photoshop窗口里显示。3.7. 继续拍摄下一张照片。3.8. 拍摄十来张照片后要及时保存照片。3.9. 先关闭相机控制按纽。并保存拍摄条件到默认值。3.10. 在photoshop中保存刚拍摄的照片到指定文件夹中，保存后要关闭照片。3.11. 保存并关闭全部照片后重新打开相机控制窗口继续拍摄。3.12. 拍摄全部完成后保存所拍摄的照片。需要时将照片通过网络上传到校园网服务器上，不能使用U盘或软 盘转移文件。或者将照片文件刻录到光盘上。4.关机：4.1. 关闭显微镜电源。4.2. 关闭汞灯电源。4.3. 关闭数码相机电源。4.4. 关闭电脑时点“重新启动电脑二待电脑进入关闭状态并重新启动时按电脑电源开关强制关机。注意不能直 接点击“关闭电脑”。4.5. 关闭房间电源总开关。奥林巴斯荧光显微镜使用说明和注意事项1、初次使用者事先要经过培训。2、该显微镜有2套拍照系统；传统胶卷拍照和数码拍照。根据需要可更换相应的附件。3、该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启相应的电 源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使用。4、作为明视场显微镜使用；A、接通电源后，打开显微镜底座前的电源开关，按光亮需要调节底座右侧的滑 竿。B、根据需要，调节底座光栅和聚光器光栅及其高度，可获得最佳的图象效果。C、需要图片，要把镜体上 的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。5、作为荧光显微镜使用；A、先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。B、等待期间，打开 显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。C、关闭显微镜光源，打开荧光通道。D、需 要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。注意事项：1、不要污染物镜镜头。一旦污染，先用擦镜纸擦除一遍，再用显微镜专用擦洗液擦洗，最后用镜纸再擦一遍。 用油镜镜头后，以同样方法擦洗。2、关闭显微镜电源前，先把光源调到最低。3、用过荧光镜的，注意清洁载物台，防止有害有毒致癌物污染。4、结束工作，关闭所有电源，清洁工作台和房间。5、发现漏电和其他故障，及时报告。