荧光定量PCR引物设计说明

荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beacon Designer有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲 线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，(1) 设计的时候尽量靠近基因的3端，这样能最大限度地保证扩增效率(2) 尽量跨越含子，这样可以保证检测有无基因组污染(3) 两条引物的Tm值不要相差太大(4) 产物长度保证在80200bp之间，最长300 bp。.如果想同时检测很多对 基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板 温度很有帮助。保证在产物Tm80以上(一般T=80以下的峰都是引物二聚体)，m对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同 时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与参产物的Tm 相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。(3) 相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大(当 然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的 错配就死了)，引物的3端不要有错配。(5) 一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或 反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有 合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之可以搞定一个基因。实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5端的 300-400bp区域，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。5、碱基要随机分布，尽量均匀。6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。8、引物5 端可以修饰。9、3端不可修饰，而且要避开AT， GC rich的区域，避开T/C, A/G连续结构 （2-3 个）。10、引物3端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5端大于3 端。12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信 号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反 应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累 计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这 样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲 线。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型:（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两 个反应容器反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结 果，没有监测扩增效率，定量不准。（2）参法+终产物分析。所谓“参法”是指样本与阳性参照在一个反 应容器反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不 准。（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准， 但是无法排除假阴结果。（4）参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器反应，用同样 的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑 制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。（5）外标法+过程监测+对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量 准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个 拷贝数都没有才算阴性。所谓的实时荧光定量 PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环 产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时 荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR反应的进行， PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环， 收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的 变化，从而得到一条荧光扩增曲线。PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：（1）R Green I检测模式。温度循环为945572C三步法，只有 引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。（2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe。温度循环为 9460C 二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之 间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子 回到稳定态。当Taq酶在60C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5、一3、 外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料 的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对 溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信 号的特异性，但是由于利用了 Taq酶53、外切酶活性，一般试剂厂家只 给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给 Taq酶53、外切酶活性定标， 不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质 控检测。(3) 杂交探针(Hybridization Probes )模式。温度循环为 945572C 三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一 个探针3碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针 5碱基上结合第二个荧 光染料。在55C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激 发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征 光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检 测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的 浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质 控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。RT-qPCR是由三个步骤组成：1. 反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA；2. 扩增：用PCR的方法扩增cDNA；3. 检测：实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)：1. 分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2. 反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3. 数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误 结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大 化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标 准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量 的来源物以及数据分析：1. 新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2. 整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3. 总RNA或者mRNA4. RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5. 不同的酶以及酶的不同组合6. 变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。8. 每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，参的使用，归一化的方法， 质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。RNA质量评价现在RNA定量的程序很多。最近EMBO qPCR course（-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28） 比较了用 Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量 同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法 进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA 样品的评价。RNA质量RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的 RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带 的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion微流体毛细电泳系统也是一种 较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它 通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性， 其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完 整的RNA, 4代表没有完整的rRNA带。由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA 的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3：5分 析法。我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评 价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分 别位于3；5以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果 3；5的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。QRT-PCR抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了 PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致 假阴性的结果。抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血 红素，heparin 以及IgG.是否有抑制物的评价体系：1. 通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测2. 通过部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况3. 用细菌检测临床样品的抑制4. 通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统1. RT和PCR单一酶系统2. RT和PCR分离的酶系统3. RNA逆转录引物的选择引物主要有三种：1. 随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的 结果，建议使用15nt的随机引物.2.oligo-dT:只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的 变异体以及较长的3UTR的区域比较困难3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR优化PCR优化主要有：1. 引物的浓度2. 建议使用SYBR Green I和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程：一.靶的选择和试验设计1. 针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物，探针以及反应 条件.RTPrimerDB (medgen.ugent.be/rtprimerdb),相对物种较多PrimerBank (pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html) 人,鼠Real Time PCR Primer Sets (.realtimeprimers.org) 人, mouse, rat如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考，以下的设计方案仅供参考：A. 最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer(.premierbiosoft.)B. DIY 的软件 Primer ExpressC. 如果Beacon Designer无法得到您说需要的结果，或者获得到设计方案的备 选数目不够的话，可以选择Sigma-Genosys . designmyprobe.)的服务方案，详细 周到D. 一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程 序:.biosearchtech./products/probe_design.asp.您可以挑选其中的 4-6 对引 物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的进 行比对，并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR 引物设计简介DNA引物长度：15-25个碱基 GC含量：50%左右如果引物的与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的 长度以及避免引物次级结构和3端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶 点之间的分之间的相互竞争，分之杂交，倒转重复等等会引起引物的引发探针对 结合效率降低，因此我们选择引物二聚体的AG为负值，即：10 kcal/mol.没有连 续的G/C.二、引物探针的保存一般遵循以下原则：1. 正向和反向引物保存在-20度，浓度为10mM或者10XX作浓度.探针应 该避光保存，贮存在-70度，最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周 左右。2. 输入靶序列，用 BLASTN 在 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 进行比对3. 检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针 设计4. 靶序列中避免直接重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性 结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。5. 考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过分析含子以 及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长 含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的， 特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让 下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果 在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们 还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。6. 在 RT 步 骤 时， 用 (.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具检测在特定温度 下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合 效率较低7. 尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60%或者稍小来确定高效的变 性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增 是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增 多标准曲线。用。ligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3区域.实时定量PCR体系的优化1.基本参数的优化：1) MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅 如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossingpoint)值(指 PCR达到指数扩增期时，产生一定的荧光高于背景并为仪器所识别时的循环数）， 较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的浓度选择应慎重。一般来 说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2-5mM浓度的MgCl2,对以mRNA 为模板的RT-PCR而言，则应选择的浓度为4-8mM。2）模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板 来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个 稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Cp位于15-30个循环比较 合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模 板深度。对于Cp值的确定，经验上是SYBRGreenI探针的荧光信号比本底高2 倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。2. 使用SYBRGreenI测定DNA时的条件优化：1）MgCl2的浓度：大多数引物-模板对其的要2-4mM。2）模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个 稀释的度的测定。DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在106拷贝数左右。3）引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致 使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大 增加。对于大多数PCR反应，0.3uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理 想，可在0.1-1.0UM之间进行选择，直至达到满意的结果。4）退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5笆，然后在1-2笆 进行选择。一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到 的Tm值有一定的差距。3. 用SYBRGreenI进行一步法RT-PCR的条件优化：1）MgCl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4-8mM之间选择。2）模板的浓度：RT-PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用mRNA，其浓度应在 1pg-1ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternativeRNA 作为载体进行测定。3）对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。QIAGEN 的 QuantiTect 引物对 QuantiTect Primer Assays引物设计，特别是SYBR Green方法做real-time RT-PCR的引物设计是比较考 功夫的一一引物的专一性是结果特异性的最重要保障，当需要选择较小的片断而 非全长基因来做定量时，自行设计引物如何保证专一性和特异性有时不免令人头 疼。QuantiTect Primer Assays 是 Qiagen 特别为 SYBR Green 方法做 real-time RT-PCR而设计的引物对，涵盖人类、大鼠、小鼠等7个物种基因组上13万多个 基因，这些已经反复优化、经过预证的引物对能100%保证提供高度特异和灵敏 的结果，最大的好处就是你可以节约很多时间，不必再为自行设计引物而头疼， 避免由于引物设计不当、或引物合成/纯化问题而得不到理想的结果、以及避免 由此而导致的精力、时间和实验材料的浪费一一有的时候时间就是金钱，由于总 是得不到理想的结果而不得不反反复复地重复实验，这种苦头大家或多或少都有 体会吧？ QuantiTect Primer Assays经过Qiagen专家反复验证，保证不会出现 引物二聚体，能保证得到的结果在相当宽围的保持良好的线性关系，得到比探针 法更灵敏的结果，那就不需要考虑更加昂贵的荧光探针法了，所以从某个角度来 说，购买预证引物能省时省事，也能省钱的。用来快速做基因表达分析、基因沉 默验证或者是DNA芯片结果的验证非常合适。当然，Qiagen预证引物对的合成 质量、纯度你都可以绝对信赖，如果能打个较大的折扣，那么近千元一对的预证 引物（足够做200次50ul反应，或者500次20ul反应）折半下来就不那么吓人 了，毕竟是专家预证过的引物啊。到底是省事省时还是省钱？如何权衡得失还要 自己考虑。数据库提供方便的检索界面和详细的基因特异性产品的信息，包括转 录本的信息和图示，引物扩增区段的位置和扩增区段的长度。另外，针对于同一 基因的探针和也可以在同一个数据库里面找到。值得注意的是，这个Primer的 设计针对于mRNA检测，不会检测到，所以即便样本没有经过处理也没有问题。 当然，如果是单外显子基因，或者有假基因存在的话，检测到是不可能通过 primer的设计来避免的。设计荧光定量的引物其实和普通的引物设计是一样的，只是注意要片段控制在100-250之，并且特异性要强，还有就是最好跨含子设计引物，这样一般不会 有问题的。你的没起峰，应该是引物没设计好！如果你们用的是ABI公司的仪器， 他们有购机赠送的软件，Primer Express，用来设计定量PCR的引物是蛮好的， 这个软件只要买ABI定量PCR仪都会送的，单独买是很贵的，所以要好好利用资 源，不要浪费呢！如果没有的话，可以用primer5或者6。个人觉得，跟primer同一个公司开发 的AlleleID软件也是挺好用的，AlleleID有不同的设计程序，可以让你选择是 设计Taqman探针和引物、SYBY Green的引物，还是分子信标等方法用的引物， 里面的默认参数设置都是针对不同方法的要求，例如用SYBY Green法的引物， 设计出来再用其他的软件分析，发现确实不容易产生引物二聚体，实际做实验的 效果也是挺理想的。