层析技术简单介绍及其应用

层析法的主要介绍及其应用1. 层析法的概念层析法又称色谱法1色层法或层离法（Chromatography），是一种应用很广的分离分析方法。1903年，俄国的植物学家M，CUBeT在研究分离植物色素过程中，首先创造了色谱法，这是一种根据化合物的不同结构和不同的物理，化学特性，从而具有不同吸附性能的原理，以分离混合物中的化学成分的一种物理化学分离方法，最初用于有色物质，之后应用于大量的无色物质。色谱法的名称虽然仍然沿用，但已失去原来的含义。层析法和其他分离方法比较，具有分离效率高，操作又不太麻烦的优点。因此，层析法的应用越来越广，对于近代化学科学的发展有巨大的影响。在制药、化工、农业、医学等方面都有着广泛的应用。2. 层析法的历史及原理层析法的历史 1903年3月21日俄国植物学家茨维特（Michael Tswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。茨维特被世人公认为色谱创始人。德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。 Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖. 1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。 2.2层析法的原理层析Chromatography(色谱),利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。层析法进行时有两个相，一个相称为固定相(Stationary phase )，另一相称为流动相(Mobile phase )。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。层析技术与待分离混合物中各组分的理化性质(分子自然形状、大小、获电状态、溶解度与选择性吸附剂或载体物的吸附能力，分配系数、酸碱环境(pH)、温度、极性以及分子的亲和能力等)有着直接关系2。除此，任何层析技术，均具有两相条件(即流动相和固定相)，造成流动相对固定相作单向相对运动。这种流动相推动样品中各组分通过固定相向前迁移，其运动速率与两相物质和被分离物质状态有关。由于被分离物各组分中的理化性质不同，对不同的两组或两组以上组分，具有不同的作用力，通过吸附一解吸，或离子交换、分子筛效应、静电引力，免疫特异性吸附等，造成各组间生物分子分离、迁移距离不等，最终达到被测物的分离、纯化的目的。这一技术的应用，不但能分离有机化合物，还能分离无机物，更主要的是适合于分离分析生物高分子物质，其分离范围广，适用性强。化学性稳定、灵敏度高，既可纯化又可制备，条件简便。层析技术的基本原理如此，但是不同的具体层析分离方法用到的技术原理又有所改进和不同，下面我们将根据不同的层析方法分别进行介绍。层析法的分类层析法的分类由于层析法是利用物质在不同的两相中溶解，吸附或其它亲和作用的不同，使混合物中的各组分达到分离目的，因而层析法有多种类型，也有多种分类方法。按两相所处的状态分类以液体作为流动相的称为“液相层析”或“液体层析”（liquidchromatography，LC或LC）；用气体作为流动相的称为“气相层析”或“气相色谱”rgachromatography，GC或GC)-按固定相的种类来分，又可以把液固层析分为；液固层析(1iquidsolidchromatography，LSC或LSC)，液液层析(1iquidliquidchromatography?LLC或LLC)；把气相层析分为：气一固层析tgassolidchromatography，GSC或GSC)、气液层析(gastiqu：dchromotographY，CLC或GLC)。(二) 按层析机制分类1吸附层析(adsorptionchromatography)这是利用吸附剂对不同组分有不同的吸附能力使之分离的一种层析方法。2分配层析(partitionchromatography)这是利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同的一种层析方法。3离子交换层析(ionexchangechromatography)这是利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同的一种层析方法。d凝胶层析(gelchromatography)这是一种利用凝胶对不同组分因分子大小不同而有不同阻滞作用的一种分离方法。名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离(三) 按操作形式不同分类：1柱层析(columnchromatography，CC或CC)将固定相装入柱内，装样后，用流动相沿一个方向移动而达到分离的目的。2纸层析(paperchromatography，P，C或PC)用滤纸作为液体的栽体，点样后，用适当的流动相展开，以达到分离的目的。3薄层层析(thinlayerchromatography，TLC或TLC)将吸附剂铺成薄层，点样后，用流动相展开，以达到分离的目的。名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离层析法几种主要的方法及其特点4.1薄层层析和纸层析薄层层析（T.L.C或TLC）和纸层析（P.C或PC）在层析方面具有广泛的吸引力，这是由于这两种方法可用于定性、定量和制备。它们对于痕量的分析是很方便的，效果很好。这二种层析方法应用面很广，应用的例子也很多。例如：鉴定合成过程中的副产品；测定生物放射同位素中的放射杂质，鉴定天然产物：药物的分离鉴定；食品的分析鉴定；等。虽然气相层析(GC或GC)比薄层层析和纸层析更方便，尤其在定量分析方面，但薄层层析和纸层析的某些优点超过气相层析，所以，现在这两种方法经常被使用。薄层和纸层与气层比较，有下列优点：1薄层和纸层可用于分离热不稳定的化合物。2薄层和纸层的定量重现性比较容易。3薄层和纸层能够用于很多方面，这是由于移动捆(展开剂)可以交换，而且分离过程也很容易。4双向薄层和纸层所能产生的结果和得到的资料是单相色谱操作所不能实现的。5薄层和纸层的装置简单，成本费较低。6一些样品和比较的化合物可以同时在一个简单的色谱中加以比较。7在鉴定工作中，可用颜色试验并可测定其R，值。气层可以看作是对薄层和纸层在技术上的补充和发展，此外，尚有高效液相层析(HPIC)。但还不能用新技术完全代替薄层和纸层，而且上述47的优点超过了气层和高效液相层析。虽然薄层和纸层可以交换使用，但在大多数情况下，首先选择薄层是比较方便的。此外，腐蚀性显色试剂在纸层中不能使用。4.2纸层析纸层析的基本原理及其特点纸层析法是以滤纸作为支持剂(或称为载体、担体)，用一定的溶剂系统(展开剂)展开而达到分离拘目的。固定相一般为滤纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水混合的有机溶剂，固定相除水以外，尚可用甲酰胺、缓冲溶液等。此法可用于定性、定量，也可用于分离制备。一般将样品溶于适当的溶剂中，点样于滤纸的一端，干后，悬挂在一密闭的层析筒中，用适当的展开剂展开，展开有上行法和下行法，展开完毕后，将滤纸取出，划出溶剂前沿线，阴千，以适当的显色剂显色。样品层析后，一般用比移值R，表示某一化合物在纸层析谱中的位置，如下图因为纸层析是溶质(样品)在固定相和流动相之间的连续萃取，根据溶质在两相间分配系数的不同而达到分离的目的。一定的物质在二相间有固定的分配系数，所以有固定的比移值Rf，也就是说在一定的条件下，R+值为一常数，因此可以达到分离鉴定的目的。R值一般在0到1之间。影响R值的因素很多，主要有下列几方面重要因素：1样品本身极性的大小一般说来，物质分子中极性基团增加，物质的极性就随着增加，则分配系数变大，R，值变小。增加分子中的非极性成分，则分子的极性降低，则R，值变大。2由二个氨基酸A，B组成的二肽，不管是组成AB或BA，理论上，在任何溶剂中，RfAB和RfBA值应是相等的，但在实际测定中，由于其他种种原因，如吸附等的影响，Rf值可能会有些差异!这也就是有些同分异构体能够被纸色谱分离的原因所在。3氢键的影响溶质和溶剂如能形成氢键，对R+的影响较大。4溶剂的性质用与水完全互溶的脂肪醇类作溶剂时，醇类的一CH2基数与溶质的Rf值呈反比关系，增加一CH2基，则Rf值相应的变小。同一种有机溶剂由于含水量增加，使某些溶质相应地易于进入有机相，因此，R：值也相应变大。5pH因为弱酸与弱碱的解离度与PH有关，由于溶剂pH的改变，溶质的解离度也随之改变，致使在二相中的分配系数改变，结果造成Rf值的改变。6展开温度如前所述，有机相中含水量的改变，溶质的R，值也相应改变。水在有机相中的溶解度是随温度的变化而变化的。所以展层温度的改变会使R，值有所改变。但在有些溶剂体系中，Rf值不随温度的变化而变化，因为这一类溶剂体系的组成不随温度变化而变化，或与水完全互溶。但对温度敏感的溶剂体系，在色谱分离口寸必须严格控制温度。一股温度变化以不超过0，5为宜。7滤纸的性质滤纸厚薄不匀，含水量不一致，溶剂沿着纤维方向的流动就会紊乱，导致溶剂前沿不整齐，色谱分离点畸形，影响R，值的测定。纸纤维中，如金属离子Ca2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+等含量很高时，则影响Rf值。此外，溶剂配制的时间长短、滤纸的含水量不同，展开的方向，长度和方法的不同，点样位置离溶剂槽的距离不同，溶剂槽中溶剂量的不同，平衡条件的不同等等，都能影响R，值，在做平行实验时必须予以注意。4.3纸层析的操作方法1层析纸的选择和处理用于色谱分离的滤纸必须具备下述条件。(1)滤纸质地均匀厚薄一致，全纸平整无折痕，以保证展开速度均匀。(2)具有定的纯洁度，含Ca*+、Mg+、Fe*+、C旷+等金属离子或其他显色物质愈少愈好。(3)有一定的机械强度，被溶剂浸润后仍能站立。(4)分离样品不易扩散，分离斑点轮廓清楚不拖尾。(5)垂直方向的溶剂流速左右二端基本一致，前沿平整。在分离酸性、碱性或两性物质时，展开剂和样品的酸碱度对层析结果影响很大，主要皂样品的游离形式和成盐的形式在水和有机溶剂中分配比相差极大，因此，pH必须恒定才能得出满意的层析结果。恒定pH的办法，一种是在展开剂中采用一定比例的酸碱，另一种是将滤纸经恒定pH的缓冲液处理，在中性溶剂中展开，缓冲溶液可采用柠檬酸磷酸氢二钠系统。一般可将滤纸于缓冲液中浸湿(或者均匀喷洒)，再用滤纸吸去表面的多余水液，阴干即可使用。有时也可用甲酰胺、二甲基甲酰胺等试剂予处理。在选择滤纸时，除上述条件外，如果样品量大，必须采用厚滤纸，如需在短时间内取得结果又是易于分离者，可用快速滤纸。一般常以华德门(Whatman)滤纸作为标准层析滤纸。使用国产层析滤纸一般多用杭州新华造纸厂产品。4.4固定相滤纸纤维一般有较强的吸湿性，通常可含2025的水分，而其中有6一7的水是以氢键结合的，在一股条件下较难脱去，所以纸层析实际上是以水为固定相，而滤纸纤维则起一个惰性载体的作用。在分离极性较小的物质时，为了增加它在固定相中的溶解度，常用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇作为固定帼。在特殊情况下，如分离芳香油等非极性物质时，往往用石腊油、硅油(Silicone)等作为固定相，以水溶液(或有机溶剂)作流动相，这种方法称为反相纸上分配层析。4.5展开剂的选择纸层析是否能得到满意的结果，和选择展开剂的关系极大。不可能有适用于一切化合物的展开剂，对于各类化合物必须选择其独有的溶剂系统。可以参考前入所用过的展开剂，同时要通过自己的实践，以便找出更满意的溶剂系统。一个理想的溶剂系统必须具备下述条件。 (1)被分离物质各组分的R，值在所选择的溶剂中应在0.050.90之间，彼此司的R值差不应小于0.05。检定单纯化台吻则比栘值最好在0.40.6之间。(2)溶剂系统中的每一组成与分离物质之间不发生化学反应。(3)纸层析谱所得斑点圆辂，并且圆榷程度不因点样多少而有差异。(4)分离物质在溶剂系统中的分配比恒定，最好不随温度变化而变化，而且很快达到平衡。(5)尽可能少用高沸点溶剂，便于纸层析谱干燥。(6)溶剂的规格应用色谱级或分析纯级。(7)常用流动相的极性：石油醚环己烷四氯化碳苯甲苯乙醚氯仿醋酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇0.2，HR5/20pI0.02。多元缓冲液交换剂PBE，属珠状交换剂凝胶，有PBe 118（pH11-8）和PBE（pH9-4）。在聚焦层析时，通过使用不同的洗脱液，可使交换容量发生改变，并且使pH达到更广的范围。14