临床输血检测操作规程资料

精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第1页共12页ABO血型鉴定1、测定原理根据红细胞上有或无A抗原或和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。所谓正定型，是用已知抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗A或和抗B。2、标本种类及收集要求2.1受检者血清；2.2枸缘酸钠抗凝血或未稍取血，受检者血液制成5红细胞盐水悬液使用，制备方法见本节附注。2.3标本出现中度溶血者，为不合格标本，不能用于检测。3、仪器、试剂、校准品、质控品、培养基、以及其他所需物品抗A、抗B血型定型试剂（单克隆抗体）：河北医科大学生物医学工程中心，产品注册号：国药准字S10950017，包装:抗A、抗B各1支/盒，塑料瓶，规格：10ml/支，储存要求：28避光保存，主要成分：分泌抗人A型和抗人B型血型原单抗的杂交瘤细胞培养上清液并补加一定量小鼠腹水抗体。0.9/%的生理盐水：江西科伦医药有限公司。离心机，显微镜。4、操作步骤4.1、试管法4.1.1取洁净小试管(内径10mm60mm)3支，分别标明抗A、抗B和抗A十B，用滴管分别加抗A、抗B和抗A十B分型血清各l滴（约50ul）于试管底部，再以滴管分别加入受检者5红细胞盐水悬液1滴，混和。4.1.2另取洁净小试管(内径10mm60mm)3支，分别标明A、B和O细胞。用滴管分别加入受检者血清l滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B和O型533试剂红细胞悬液l滴，混和。4.1.3立即以1000rmin离心3min。4.1.4将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以内眼观察有无凝集(或溶血)现象。如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。4.1.5观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或cisAB的发现。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第2页共12页4.1.6凝集强度判断标准4+红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。3+红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。2+红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。1+肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞。MF混合凝集外观(mixedfield)是指镜下可见少数红细胞凝集，而极大多数红细胞仍呈分散分布。-表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。4.2玻片法4.2.1取清洁玻片1张(或白瓷板1块)，用蜡笔划成方格，标明抗-A、抗-B和抗-A十B，分别用滴管滴加抗-A、抗-B和抗-A十B分型血清l滴于标明的方格内，再各加受检者2红细胞悬液1滴，混和。4.2.2另取洁净玻片一张(或白瓷板1块)，用蜡笔划成方格，标明A细胞、B细胞和O细胞，用滴管各加受检者血清1滴，再分别用滴管滴加A、B和O型试剂红细胞悬液1滴。4.2.3将玻片(或白瓷板)不断轻轻转动，使血清与细胞充分混匀，连续约15min，先以肉眼观察有无凝集(或溶血)反应；再在低倍镜下观察结果。5、结果判定ABO血型正反定型结果分型血清+受检者红细胞受检者血型受检者血清+试剂红细胞抗-A抗-B抗-A十BA细胞B细胞O细胞+-+A-+-+B+-O+-+AB-注：+为凝集；-为不凝集。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第3页共12页6、注意事项：346.1分型血清必须为批批检试剂，且在有效期内使用；质量性能符合要求。试剂开封后必须贴上开封日期、开封人标签，用毕后应放置冰箱保存，以免细菌污染。试剂开封后有效期为一周。6.2试剂红细胞以3个健康者同型新鲜红细胞混和，用生理盐水洗涤1次，以除却存在于血清中的抗体及可溶性抗原。或使用合格的商品诊断红细胞。试剂红细胞有效期：自制的为15天，商品的为试剂有效期。试剂开封后必须贴上开封日期、开封人标签，用毕后应放置冰箱保存，以免细菌污染。试剂开封后有效期为一周。6.3生理盐水启用后，有效期为二周。6.4所有试剂在开封或使用时，必须检查是否有变质；凡可疑者，必须更换新的试剂进行检测工作。6.5试管、滴管和玻片必须清洁干燥，防止溶血。6.6操作方法应按规定，一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。6.7按理IgM抗-A和抗-B与相应红细胞的反应温度以4为最强，但为了防止冷凝集现象的干扰，一般仍在室温(2024)内进行试验，37可使反应减弱。6.8离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。6.9观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。6.10判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。6.11对于可能存在不完全抗原的时候，应在各反应方加入凝聚胺试剂，以检验不完全抗原的存在。6.12对于可疑结果，必须更换所用的试剂，重新检测。6.135%红细胞悬液的配制：用生理盐水洗涤红细胞3次。根据下表进行红细胞悬液的配制悬液浓度（%）压积红细胞（滴）盐水（滴）212ml(40)510.8ml(16)-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第4页共12页7、操作性能概要7.1正反定型结果不一致的原因：7.1.1原因：有技术性问题或红细胞和血清本身的问题，常见者有以下几种：7.1.1.1分型血清效价太低、亲和力不强。如抗A血清效价不高，可将A亚型误定为O型，AB型误定为B型。357.1.1.2红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，误判为阴性反应。7.1.1.3受检者红细胞上抗原位点过少(如亚型)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤：以及类B或cisAB等。7.1.1.4受检者血清中蛋白紊乱(高球蛋白血症)，或实验时温度过高，常引起红细胞呈缗钱状排列。7.1.1.5受检者血清中缺乏应有的抗-A及或抗B抗体，如丙种球蛋白缺乏症。7.1.1.6各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体.7.1.1.7由细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。7.1.1.8血清中有意外抗体，如自身抗I，常引起干扰。7.1.1.9老年人血清中抗体水平大幅度下降正反定型结果不一致的解决办法如发现ABO正反定型结果不一致，先要重复作试验1次。严格执行操作规程，使用质量合格的试剂以及细心观察和解释试验结果，就可解决明显的问题，对一些疑难问题月必须进一步研究。7.1.2检查步骤：7.1.2.1另从受检者采取l份新鲜血液标本这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不符合。7.1.2.2将红细胞洗涤数次，配成5生理盐水细胞悬液，用抗A、抗B、抗Al，抗A十B及抗H做试验可以得到其它有用的信息。7.1.2.3对受检红细胞作直接抗球蛋白试验，如结果呈阳性，表示红细胞已被抗体致敏。7.1.2.4用A1、A2、B、O红细胞及自身红细胞检查受检血清。如果怀疑是抗I，用O型(或ABO相合的)脐血红细胞检查。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第5页共12页7.1.2.5如果试验结果未见凝集，应将细胞及血清试验至少在室温和4放置30min，用显微镜检查核实。7.1.2.6如疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗A或抗B血清作吸收及放散试验以及受检者唾液作A、B、H血型物质测定。后者只对80HAB分泌型的人有用。7.1.2.7如试验结果红细胞呈绢钱状排列，加等渗盐水l滴，混和，往往可使绢钱现象消失。应注意不应先加盐水l滴于受检者血清中而后和红细胞作试验，以免使血清中抗体被稀释。7.1.2.8如受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用下列方法进行鉴别：7.1.2.8.1观察细胞与抗A及抗B的凝集强度，与抗A的反应要比与抗36B的反应强。这种区别用玻片法作试验更为明显。7.1.2.8.2用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗B不凝集自身红细胞上的类B抗原。7.1.2.8.3检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质而无B物质。7.1.2.8.4核对患者的诊断，类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。7.1.2.9如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或产生机制不太明了的Tn受体所引起。多凝集红细胞具有以下特点：7.1.2.9.1能被人和许多家兔的血清凝集。7.1.2.9.2能与大多数成年人的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。7.1.2.9.3不被脐带血清凝集。7.1.2.9.4通常不与自身的血清凝集。8、临床意义用于检验人的ABO血型归属。9、参考文献全国临床检验操作规程（第3版）-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第6页共12页Rh（D）血型鉴定1、实验原理红细胞与抗D抗体发生凝集反应表明该细胞有D抗原，反之，无凝集现象表明试验的红细胞缺少正常强度的D抗原。2、标本收集和制备无菌操作收集血液标本,收集后尽可能立即进行实验。如果不能立即实验,应将样品贮存于2-8C。收集在ACD、CPD、CPD2A液中的血液标本,不超过21天仍可进行实验，但是加EDTA、肝素和凝集的血液标本，实验应在2天内进行。3、仪器、试剂、校准品、质控品、培养基、以及其他所需物品：Rh(IgM)血型定型试剂（单克隆抗体）：上海血液生物医药有限责任公司，产品注册号：国药准字S20060018,包装、规格：每盒内装有1支试剂，10ml/支，储存要求：存放28，有效期内使用。4、操作步骤4.1玻片法：4.1.1干净玻片上加1滴抗D。4.1.2再加入1滴40%-50%的被检红细胞悬液。该红细胞悬液可以是盐水悬液，37也可以是悬浮于自身血浆或血清中的红细胞。4.1.3在圆形的玻片区域中混匀，前后缓慢摇晃玻片。2分钟左右肉眼判读结果。不要将试剂的干燥与凝集相混淆。4.1.4如果是阴性，需要试管法重做一遍实验。4.2盐水试管法4.2.1加一滴抗D试剂于预先标记好的试管中4.2.2再加1滴约3%5%红细胞生理盐水悬液于试管中。混匀。4.2.3离心，速度和时间可选择以下二种之一：转速1000rpm，时间一分钟1分钟或3400rpm，时间15秒。4.2.4检查是否溶血（溶血可能是阳性结果，或者是细菌污染）然后轻轻摇晃，是细胞再悬浮起来。4.2.5观察凝集状况，并立即记录结果。必要时可借助显微镜。4.2.6若是阴性结果，需在37孵育15分钟-30分钟，然后再离心观察结果。结果若呈阴性需进一步确认是否是弱D。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第7页共12页4.3微量板法（U型板）4.3.1加一滴抗D试剂于U型底的微孔中。4.3.2再在微孔中一滴约3-5%的被检红细胞悬液，细胞悬液需事先制备于生理盐水中。4.3.3用机械的方法将U型板混匀。4.3.4用板式离心机离心：2000rpm,时间30秒。不同的离心机，不同的微量板所需要的离心条件有所区别，正确实验的结果需要适当的离心，使反应板产生清晰的细胞扣及透亮的上清液。4.3.5检测溶血情况（溶血可能是阳性结果，或者是细菌污染）4.3.6结果判断：用机械震荡U型板，再悬浮细胞，根据悬浮情况来判断凝集。阳性反应，出现红细胞凝集，而阴性反应在微孔中会出现均匀细胞悬液。4.3.7可用肉眼和自动化判读结果。4.3.8如果呈阴性，需要试管法重做一遍实验。5、参考值范围阳性反应：出现红细胞凝集，为RhD阳性。阴性反应：红细胞不出现凝集，为RhD阴性。6、产品性能指标抗D（IgM）效价大于等于1：64（ccDeeO型）7、方法的局限性VI本实验不能凝集CategoryD细胞，对于阴性和弱阳性结果，按有关安全输血规范进行确认实验，必要时送血型参比实验室进行确认。8、注意事项388.1试剂含有0.1%W/V叠氮钠，如果摄入会中毒。8.2试剂如出现混浊则不能使用，若开瓶使用时间较长后，最好用已知RhD阴性、RhD阳性红细胞检查结果是否符合，以防制品污染、变质失效，而造成错误。及时贴上开封时间标签，在效期内使用。8.3由于人红细胞的D抗原往往表现较弱，故必要时进行显微镜镜检，以免错判结果，特别是阴性结果时。8.4Rh血型鉴定应严格控制温度与时间，因Rh抗原、抗体集反应凝块比较脆弱，观察反应结果时，应轻轻侧动试管，不可用力振摇。8.5对于结果可疑的，必须洗涤红细胞后重新检验。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第8页共12页9、操作性能概要9.1假阳性反应原因分析：9.1.1试剂中存在具有其他特异性的抗体（指不完全抗D抗体），因此，对疑难抗原定型时，建议用不同来源的抗血清同时做两份实验。因为使用两份特异性相同的抗血清得到不一致的结果时，就会使检验人员意识到有进一步实验的必要。9.1.2多凝集红细胞与任何人血清会发生凝集。9.1.3当用未经洗涤的细胞做实验时，试样中的自身凝集和异常蛋白质可能引起假阳性结果。9.14试剂瓶可能被细菌、外来物质或其他抗血清所污染。9.2假阴性反应原因分析：9.2.1搞错抗血清每次试验时应细心核对抗血清瓶子上的标签。9.2.2试管中漏假抗血清在加入细胞悬液之前，必须检查试管中有无抗血清。9.2.3某种特定的抗血清不能和其他相应抗原的变异型起反应。9.2.4如某种抗血清含有主要对抗Rh复合抗原的抗体，则可能与独立的基因产物的个别抗原不发生反应。这在抗C血清最为常见，因为很多抗C血清含有反应性更强的抗Ce成分。9.2.5未遵照抗血清使用说明书做试验，如抗血清和细胞的比例以及温育的温度和时间不正确。9.2.6抗血清保存不妥，试剂中的免疫球蛋白变质。10、参考文献：全国临床检验操作规程（第3版）-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第9页共12页抗体筛选和鉴定试验1、原理红细胞血型抗体分子的物理特性与血清学的反应性之间有着直接的关系。可39分为IgM和IgG球蛋白抗体IgM为天然抗体，在盐水介质中能直接相应的红细胞，使之发生肉眼可见的凝集反应。IgG为免疫抗体，常经妊娠或输血等免疫产生。在盐水介质中不能凝集而只能致敏抗原的红细胞，且必须通过特定的方法使致敏红细胞发生凝集。如牛血清白蛋白、酶、抗球蛋白、凝聚胺、凝胶（或玻璃）等方法。2、方法待检血清需要使用多种方法进行鉴定。一般使用盐水法、酶方法、抗球蛋白法、凝聚胺法或凝胶法检测抗体。在检测到弱抗体时，可以利用适当增加血清的细胞比例、适当增加孵育时间、加入低离子强度溶液增效剂或PEG聚氧乙烯乙二醇等方法增加反应的敏感性。不同的抗体在不同的方法和条件下可以有不同的表现。这些特性为判定抗体特异性提供了参考信息。3、试剂3.1、红细胞：选取三个以上的O型红细胞组成一组筛选细胞（已知抗原）。3.2、谱细胞：选取八个以上的O型红细胞组成一组谱细胞（已知抗原）。4、操作4.1、不规则抗体的筛选：用筛选细胞（1、2、3号），同患者血清在三种介质中（盐水、凝聚胺、看球蛋白）反应，需做自身细胞对照。，4.2、不规则抗体的鉴定：对筛选阳性的患者应检查其抗体的特异性。用一组谱细胞（1-11）同患者血清在三种介质中（盐水、凝聚胺、抗球蛋白）进行抗体的筛选，需做自身细胞对照。5、结果判断阳性反应：出现红细胞凝集。表示红细胞上有相应抗体存在。阴性反应：出现红细胞不凝集。表示红细胞上没有相应抗体存在。结合谱细胞反应格局，确定抗体特异性。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第10页共12页6、临床意义6.1、定血型；6.2、测效价6.3、可能几率：正确的抗体鉴定，必须有充分的谱细胞支持。7、标本要求7.1、按照一般的血液样本采集步骤采集血液标本。该标本可于4或0以下冷冻保存三周或数年。一般不需特殊处理。7.2、应用EDTA抗凝标本，可反应体内红细胞被补体致敏的真实情况。抗凝标本也用于直接抗球蛋白试验，并可提供洗脱技术所需的红细胞来源。7.3、需要一管新鲜收集的凝固的血液标本用作血清研究。若怀疑冷抗体引起的直接抗球蛋白试验阳性，其血液标本凝固应保持在37，直到血清40被分离出来为之。8、注意事项8.1、仅用于体外诊断8.2、试剂贮藏温度2-8；8.3、试剂有效期两个月。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第11页共12页改良低离子聚凝胺法促进剂实验操作规程1、目的：减少交叉配血试验的假阳性。2、适用范围：交叉配血、血型鉴定、抗体筛检血型血清学试验。3、试剂来源：中山市生科试剂仪器有限公司4、采集与处理：4.1脉采血3-4ml，并观察是否溶血、乳糜血，如有此现象应再留标本并做记录。4.2检查留样试管、标签、标号、姓名、血型是否齐全，如有遗漏应拒收。04.3将血标本试管放37C水浴中10分钟，离心。5、标准操作：5.1主（次）管加入受（供）血者血清2滴，加供（受）血者4%红细胞盐水悬液1滴。5.2各管加LIM0.8ml，混匀，静置1分钟，各管加Promoter1滴，混匀，3000转/分离心15秒，倒出上清液（残留约0.1ml），扣摇，肉眼可见明显的凝集状（如无凝集须重做），加假凝集清除液1滴与管底，轻摇，凝集1分钟内消失呈均匀混悬液，为阴性，凝集1分钟内不能被消除，即为阳性。5、结论：阳性表示受（供）血者血清中含供（受）者红细胞血型Ag相应的Ab（IgG、IgM），供受血者不相容，阴性表示供受血者相容-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档精品文档文件类型：作业指导书文件编号：JCXRMYY-JY-015-2009文件名称：临床输血检测操作规程第01版第0次修改第12页共12页6、注意事项：7.1操作者须严格按照操作说明进行试验，红细胞浓度、血清滴量、反应时间、离心速度等均可影响试验结果。7.2若为弱凝集结果，本试剂盒按下述试验操作方法，还可进一步提高试验灵敏度。试验操作方法如下：7.2.1检测管中加试验血清2滴，4%红细胞盐水悬液1滴。7.2.2加LIM0.8ml，混匀，静置1分钟，各管加Promoter2滴混匀，3000转/分离心15秒，倒出上清液（残留约01ml），扣摇，肉眼可见明显的凝集状（如无凝集须重做），加假凝集清除液1滴于管底，轻摇，凝集1分钟内消失呈均31匀混悬液，为阴性，凝集分钟内不能别消除，即为阳性。7.3检测标本应为非抗凝血，如标本中含抗凝成分的含量过高明显干扰凝集反应，可适当调加Promoter的滴量，以中和抗凝成分的干扰。007.4试验温度以20-30C为宜，若为寒冷凝集，37C水浴分钟，在此温下观察，凝集消失，说明冷凝集素存在。7.5肉眼直观判断的结果应确保与显微镜下观察结果一致，直观不能明确判断的可疑结果须镜检，镜下：阴性结果应该是单个RBC均匀分布，有RBC凝集状散在的即为若阳性。7.6试验质量检验：取自身血清与自身红细胞用本试剂盒试验方法作自身阴性对照试验，取IgG抗D血清与RhD（+）RBC用本试剂盒试验方法作阳性对照实验，对照实验符合，试剂有效。7.7疑难结果以抗人球蛋白实验（AGT）作终判断试验，试验操作参照经典AGT0（在AGT中，加入本试剂盒中的LIM0.8ml37C孵育时间可缩短至10分钟）。7.8本试剂盒适宜大多数血型抗体的检测，但对kell血型系统抗体（主要存在白种人群）检测效果较差，由于我国黄种人群中kell血型系统抗体阳性者罕见，因此适合在国内推广。可补充抗人球蛋白试验，以提高对kell血型系统抗体的检出率。-编制人/修改人：校核人：审核人：批准人：精品文档精品文档批准日期：年月日实施日期：年月日精品文档