慢病毒包装质粒

慢病毒包装质粒(1) 慢病毒包装质粒慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而大大增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从而保证其高效表达并且对细胞不产生随机整合可能产生的伤害。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。 慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。慢病毒包装系统由一个包装质粒混合物（Mi*）和一个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图片来自MIT）：载体中含有HIV的基本元件5LTR和3LTR以及其他辅助元件等。不同系统包装质粒混合物也不一样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，比例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋白的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因子rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。 以下介绍用293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。准备试剂篇?核心质粒；?指数生长的293T细胞；?病毒包装质粒Mi*:1 g/l（Mi*=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所用的包装病毒质粒也不一样，此系统可用于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。?转染试剂：turbofect， 也可以用其它的如lipo2000等。1细胞分盘通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基平铺细胞于35mm 培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80以上）。将细胞置于含5CO2的37温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前 2h 换液（用1.5ml 完全培养基置换旧的培养基）。2混匀核心质粒和包装质粒取无菌1.5ml EP管，加入400l 无血清DMEM，加入1.5g 核心质粒和1.5g 病毒包装质粒，及6l turbofect (turbofect ：质粒2:1），充分混匀，静置15-20min。3孵育将这400l 的混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5CO2的37温箱孵育。4收集病毒上清6-10 h后吸去培养基，加入2.5ml37预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，40h左右可以收集含慢病毒的上清进行感染或者分装后置于80储存待用。（1500rpm离心五分钟，一般可收集到2ml 含病毒上清）5病毒感染1）将细胞平铺于6孔板或12孔板，最佳密度为*%70。2）对于六孔板：（12孔板减半）Infectmouse cells：800-1600l virus + 1600-800 l fresh medium =2.4 ml totalInfecthuman cells：200-800l virus + 1200 l-800 l fresh medium =2 ml total3）加入2-5g/ml polybrene, 充分摇匀后置于37温箱孵育。4）12-24h 后换液，长满后传代或者检测表达，做实验。Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles在做病毒包装实验中，有科研工作者常遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功。有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒?腺病毒 or 慢病毒？慢病毒可以插入细胞基因组，稳定表达，持续时间长。 包装周期短（一般要两个月），感染效率相对于腺病毒要低很多。不能扩增，一次包装的病毒用完后如果再需要只能重新包装。一次包装所得到的的病毒滴度也相对较低（10 的 8 次方 pfu/ml），不大适合直接用于动物实验。腺病毒感染效率高，很多细胞都能达到近 *%。纯化后的腺病毒可以直接进行动物活体注射。可以在体外扩增，每次使用完后，可以自己用包装细胞进行扩增，节约成本。一次包装所得到的滴度较高（纯化后为 10 的 11 次方 pfu/ml，未纯化的为 10 的 10 次方 pfu/ml）。不整合到基因组，无法稳定表达。表达时间相对于慢病毒较短（两三周这样）。包装腺病毒的周期会比慢病毒长一些（一般要两个半月），因为腺病毒包装过程相对较繁琐。病毒包装的关键点病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统 （尽量使用成熟的商业化载体系统）、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制 （24、48 小时的细胞及荧光状态判断）、目的基因对病毒包装影响 (基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功）。如何提高病毒感染效率病毒感染效率主要和三方面有关，病毒本身的滴度，目的细胞种类以及个人操作问题。在这里我先把操作问题排除，你若想提高病毒感染效率，可以先提高病毒滴度，在感染的过程中适当的加大病毒感染量或者通过多次加入病毒提高感染率。其次，你也可以加一些辅助感染试剂来提高病毒感染率的，如 polybrene。另外，你要根据不同的目的细胞加入合适的病毒量，这样才能更精确的提高病毒感染效率。293T 细胞有关293T 细胞包装慢病毒时，转染方法优先选择阳离子脂质体方法。氯化钙法转染效率相对低，出毒效率相对低。且对氯化钙法对 pH 值要求很苛刻，差一点都不行。阳离子脂质体法效果比较好，但常规使用的 Lipo2000 细胞毒性大，有钱的可以使用低毒性的 Fugene HD，钱少的可以选用其他公司的 Lipofiter 阳离子脂质体产品，效率和 Lipo2000 差不多，毒性基本没有。病毒浓缩有关病毒一般可以收两次，可以在 48 h 和 72 h 各收一次。如果你不想麻烦浓缩病毒的话，也可以不浓缩，直接将收集的病毒上清作为要感染的细胞的培养基，但是可能效果会不太好。并且一般收病毒时，培养基的营养已经损耗了很多，那样直接培养感染细胞会损害细胞，所以建议还是进行浓缩后再感染。如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。纯化后病毒如何保存？纯化后的病毒用无血清的 DMEM 保存就可以了，一般放在 -80 度进行长久保存。如果收集的上清不想立即纯化可先放在 -80 度，等下次收集的一起纯化。目的蛋白在包装细胞中或者滴度测定细胞中会表达的，滴度测定就是根据目的蛋白表达情况来进行操作的。(2) 慢病毒包装质粒慢病毒载体构建及包装流程（一） 实验流程（1和2为并列步骤）1.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（codingsequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。(二) 实验材料2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspa*2, pMD2G,pLV*-IRES-ZsGreen1/pLV*-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。载体信息1) 慢病毒克隆载体图谱如下：2） 包装质粒信息如下：PMD2G载体图谱和序列信息PSPA*2载体图谱和序列信息：细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含*%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DH5。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。(三)流程图(3) 慢病毒包装质粒慢病毒系统工作原理?该系统是如何工作的慢病毒和逆转录病毒基因递送系统利用了逆转录病毒复制方面的性质以获得目标核酸序列稳定的整合。核酸转染只能获得瞬时的转基因表达，而基于逆转录病毒和慢病毒的系统却可以获得外源基因稳定的整合，外源基因于是被遗传下去随重复的细胞分裂持续表达。慢病毒和逆转录病毒载体的一个重要特征是他们产生的是复制有缺陷的，即自身无活性的病毒颗粒。这使得目标序列得以转运，而在目标细胞中不存在连续的病毒复制。更重要的是，因为它们中的一些是人源病毒，这免去了使用活的病原体所伴随而来的危险。复制缺陷的病毒是通过反式互补的方式生产的（图4），其中包装细胞与三种不同的质粒（见下文）共转染（图5），它们一起表达产生有感染能力的病毒颗粒所需的全部蛋白，并带有递送所需的目标核酸序列。尽管很多慢病毒载体系统基于转运两个辅助质粒（第二代）和转运质粒，一些更新的系统（第三代）则将包装和包膜构建在三个质粒上再与转运质粒结合。用于构造复制缺陷的逆转录病毒或慢病毒的典型的转运质粒和两个辅助质粒如下文所述：图 4. 制作慢病毒和逆转录病毒载体。慢病毒载体（左边）的生产：将一个包装细胞系（293T293FT）与表达cDNAshRNA的转运质粒、两个辅助包装质粒共转染，辅助包装质粒编码结构和包膜（通常为VSV-G）蛋白。包装细胞产生有感染能力的颗粒，其基因组仅编码来自于转运质粒的序列，这可用于转染目标细胞。逆转录病毒载体（右边）的生产：与慢病毒生产类似，主要的差异在于第一步只转染一个质粒。只将转运质粒转入包装细胞系（Phoeni*），包装细胞系内已有辅助构建体。改编自。转运载体该质粒用于将目标基因递送至靶细胞。U3区域和其他3LTR转录活性序列被切除，这导致它成为一个自身无活性的LTR（这样的LTR被认为比完整的有活性的LTR更安全，因为后者能够激活插入位置附近的基因）。5LTR驱动包装基因RNA的表达，该转基因由载体内的启动子驱动 11 。病毒酶蛋白Gag和Pol：这些病毒蛋白是病毒粒子的成熟所需要的。Tat和Rev上调转录活性和核转运RNA基因组。这些附属基因已被剔除以减少重组发生的可能性和增加安全性（见下文安全性一节） 11 。在新一代的慢病毒系统中，Tat已被剔除，Rev被置于一个单独的载体上以增加安全性。包膜蛋白注意：由于-逆转录病毒和慢病毒gag、pol和env基因间的亚型差异，转运质粒和包装质粒不能够互换。操作慢病毒和逆转录病毒时的安全问题处理病毒载体时需要采取的行动包括：穿着适当的个人防护设备（即实验服和手套；一些公司建议带两双手套）在二级洁净层流柜内操作所有的工作台表面都要进行消毒（尤其是溢出、溅出或产生气溶胶后）采用二级生物安全柜或增强型二级生物安全柜关于处理慢病毒和逆转录病毒的更多信息和实验室生物安全水平标准，请询问NIH和美国疾病控制与预防中心健康和安全办公室。