福建农林大学 蛋白质组学复习材料

1. 遗传图谱、物理图谱、基因组图谱这三个图谱之间的相关性遗传图谱：采用遗传学分析的方法将基因或其他DNA分子标记在染色体相对位置上构建 的连锁图。表示不同基因之间的相对位置，以及不同基因之间的相对距离！物理图谱：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定基因组的实际位 置所构建的位置图。遗传图谱与物理图谱的共同之处都是确定基因或DNA分子标记在染色体上的排列位置。基因作图(gene mapping)是一种遗传学作图，用来定位染色体中特定的DNA片段。是 基因组研究的成果之一，主要分为以重组率为定位依据的遗传舆图，以及以DNA片段实际 位置为依据的物理舆图。2. 蛋白质组学与传统蛋白质化学的区别 蛋白质组学研究与传统蛋白质化学研究不同。传统蛋白质的研究主要针对单个蛋 白质。蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。 蛋白质化学包括研究蛋白质的结构和功能，通常涉及物理生物化学或机械酶学，蛋 白质组学的内容是系统生物学，而不是结构生物学。蛋白质化学研究工作通常包括完整序列测定、结构测定以及进行结构控制功能的模 型研究;蛋白质组学需进行复杂混合物的分析，通过在数据库匹配工具下进行部分序列测定。 3.蛋白质组学与基因组学研究技术上有什么区别？基因组学蛋白质组学环境静态动态数量少多能否扩增利用PCR扩增无法扩增检测技术利用互补链抗原抗体结合对象唯一不同实体基因组学是一门关于基因组图、测序和基因组分析的科学，基因组学表达的最终产物是一组 蛋白质，即蛋白质组。蛋白质组学是在基因组学的研究基础上发展起来的。1. 蛋白质组学与基因组学的区别。 蛋白质表达水平不能从mRNA表达水平来预测。 蛋白质组与它的状态相对应。2. 上述区别的根本原因是蛋白质组学研究对象比基因组学研究更复杂，为什么？ 数量多、结构更为复杂、是动态反应发育过程 蛋白质的组成及结构比基因更复杂； 蛋白质的数目远大于基因的数目； 基因是相对静态的，生物体中的基因组在不同环境下是相同的，而蛋白质是动态的， 随时间、空间的变化而变化。3. 2-DE技术与微阵列(Microarray)2-DE是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离)，然后 再进行SDS-PAGE(按照分子大小)，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。是针 对大量蛋白质的分离手段。DNA微阵列技术(microarray)指在固体表面上固定成千上万DNA克隆片段，用荧光或其他标 记的mRNA,cDNA或基因组DNA探针进行杂交，从而同时快速检测多个基因表达状况或发 现新基因，进行DNA序列分析等的一种新技术，其基本原理是基于分子杂交技术。微阵列技 术是一种探索基因组功能的有力手段。4. 2D-HPLC （多维液相色谱）色谱分离技术的优点，与2-DE的区别。色谱定义：任何将混合物组分在两相中（固定相和流动相）进行分配的分离技术。原理：混合物溶解在同一溶剂中，当流动相流经固定相时，混合物组分可以与溶剂以及固 定相基质分子间发生作用。HPLC优点：（包含区别） 速度快几个小时可完成全部分离，而2-DE分离一般需要12d。 自动化 由于在溶液状态样品处理方便、快速，避免了 2DE从胶上回收样品的繁 复操作，分析过程易于与质谱联接。 多用途 对各种蛋白质均适用，而2DE对分子量过大（200kD）或过小（10kD）蛋白 质不易分离。5. 1-DE电泳技术的优缺点优点： 免除了样品从1D胶向2D胶过渡时的繁复操作。 与准确、灵敏、高分辨的质谱鉴定技术相结合，可能发展成2-DE的替代方法之一。 缺点： 1-DE得到的分离度是相当有限的； 在凝胶上的单一蛋白质条带实际上可能含有多种蛋白质； 在胶上蛋白酶切和多肽序列的直接测定方面还存在一些问题。1. 什么叫电泳？电泳的载体分哪两大类？凝胶作为载体的特点电泳技术就是由各种带电粒子在电场中迁移率不同而进行分离的一种技术。电泳的载体分凝胶电泳、有两性电解质的载体？凝胶作为载体的特点： 孔径与蛋白质分子大小相近，而且具有制胶方便、易于显色、透明等优点，是双向 凝胶电泳的首选支持介质。 凝胶通过分子筛的作用增强了蛋白质迁移时依赖于分子大小的分离能力。2. 样品的制备包括哪几个过程，细胞破碎裂解获取蛋白质的方法，可以分为哪几类？过程：细胞的破碎、裂解、蛋白质沉淀及杂质的去除 根据工具的不同，细胞破碎分为：机械法（研磨法、组织捣碎法）、物理法（超声 波处理法、反复冻融法、冷热交替法、压力杯法）、化学与生物化学法（有机溶剂处 理法、酶解法、自溶法、渗透压冲击法）； 根据破碎力度的不同，细胞破碎方法分为：温和的方法、剧烈的方法3. 样品制备过程中遵循的原则（1） 要保证蛋白质的完全溶解 （2）要避免蛋白质降解或丢失（3）要去除杂质的干扰（4 ）勿反复冻融以制备好的样品4. 蛋白质裂解的buffer包括哪几个方面？ 变性剂:改变溶液离子强度和pH值，破坏蛋白质与蛋白质之间的相互作用；通过 改变溶液中的氢键，破坏蛋白质的二级结构和三级结构，使蛋白质充分伸展。 表面活性剂：有助溶、变性和保护蛋白质的作用 还原剂：破坏蛋白质的二硫键，使蛋白质处于还原状态 载体两性电解质：屏蔽蛋白质分子表面的疏水基团，增加蛋白质分子的溶解度；阻 止蛋白质样品和IPG胶条中固相化的两性电解质发生相互作用 蛋白酶抑制剂：避免细胞破碎后细胞自身的蛋白质水解酶被释放出来并被激活，导 致蛋白质组成分变得更加发杂5. 样品提取中有不同的杂质，不同杂质用什么去除？ 核酸沉淀法去除核酸：是用核酸内切酶进行降解 有机溶剂沉淀法去除杂质：1）多糖超速离心法2）脂类丙酮沉淀，此外，蛋白质裂解液的变性剂也可减少蛋白质与脂类的结合3）次生代谢物或磷脂TCA/丙酮沉淀 抑制剂去除多酚类物质 透析法去除盐离子和外源性带电小分子6. 2-DE 一维和二维电泳的原理蛋白质双向电泳的第一向通常是等电聚焦-根据不同蛋白质分子所带电荷量的差异，以 等电点聚焦技术进行分离（蛋白质的等电点）。该原理基于2个前提-蛋白质是两性电解质； 载体两性电解质所形成的连续pH梯度二维电泳-根据蛋白质的相对分子质量大小不同，通过SDS凝胶电泳进行分离，相对分 子量小的跑的快。7. 2-DE染色有哪几种方法？区别和优缺点 考马斯亮蓝染色：较准确地定量，能与质谱兼容；大多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，染色时间较长 银染：灵敏度较高；线性差，与质谱不兼容，试剂盒价格昂贵 负染：提高PAGE胶上蛋白质的回收率，可与质谱兼容；定量不够准确 荧光染色：对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，灵敏度与银染相当，线性范围高于银染；价格昂贵，需要价格不菲的荧光扫描仪检测信号8. 什么叫胶上酶解？酶解常用的酶有哪几种？为什么用有双识别位点的酶来切？胶上酶解:胶上的蛋白质不需要脱离胶体可直接把含有蛋白质样品的胶体放在溶液里进行 酶解。酶解常用的酶：胰蛋白酶、Glu-C（V8蛋白酶）为什么用有双识别位点的酶来切：质谱仪常处理肽段长为68个33，双识别位点能更频繁 切割肽段以达到要求的长度。若为单识别位点，切割长度太长，无法作进一步分析。9. 2-DE方法中存在的一些问题？ 低丰度蛋白质点的检测不够灵敏 极酸和极碱性蛋白质的分离尚无法再胶上实现 高分子质量蛋白质的分离相对困难，常导致缺失10. 在PAGE中加入SDS和BETA-巯基乙醇的作用SDS-一种很强的阴离子表面活性剂，可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的高级 结构，强还原剂BETA-疏基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。1. 生物质谱仪组成三部分？每部分起什么作用质谱技术的原理：将样本分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异来分离并检 测离子的相对分子质量。 离子化源：将肽段转化为离子 质量分析器：根据离子的质量/电荷比（m/z）的不同来分离离子 离子检测器：检测质量分析器分离后的不同离子2. 质谱技术两种电离技术（MALDI-MS、ESI-MS）、基质辅助激光解吸附电离（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization）电喷雾离子源（ESI）（Electron Spray Ionization）3. 基质所起的作用：防止肽段聚集；作为质子化试剂；吸收激光防止肽段破碎。4. 337nm脉冲光作用：让基质吸收光的脉冲能量防止离子化；让基质瞬间被脉冲，防止 肽段讲解破碎。5. MALDI-TOF原理，几种不同的模式，为什么线型TOF带有误差原理：TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不 同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比。模式：线性模式、反射器模式、延迟提取模式线性模式带有误差：用连续提取离子的线性模式，TOF仪器的质量分辨率和测量准确度相 对较低，测量误差在2%左右，这是由相同质荷比m/z的离子从加速器进入TOF质量分析器 时的速度不同造成的，即“非公平起始”。初速度不同，相同质荷比的离子到达的时间不同。6. MALDI-TOF-MS内部组成信息，源后衰变（PSD）原理是指在MALDI离子源中产生的离子（母离子）在飞行管道飞行过程中可能发生裂解， 分解为中性碎片和子离子。7. ESI让肽段带上电的原理蛋白质溶液通过高压电针，弥散成带电液滴形成的细雾。周围的溶剂分子很快蒸发，带 电的大分子被完整的吸入气相。在穿过电针时加入的质子是大分子带上了额外的电荷。8. ESI和MALDI两种技术的区别 MALDI只能让肽段带一个电荷，ESI让肽段带上多电荷层。 MALDI是样品跟基质混合，在结晶状态下发生电离，ESI是让样品在溶液中就可 发生电离。 离子源方法不同，即让肽段带上电的方式不同。 MALDI获得的是肽段质量指纹图谱的信息，ESI获得的是每个肽段中氨基酸的组成信息。1.蛋白质磷酸化作用使蛋白质的功能延伸改变蛋白质的疏水性激活或者抑制某一酶活性在细胞信号传导途径中，蛋白质磷酸化可以使蛋白质变为活性