蛋白质浓度的测定

实验九 蛋白质浓度的测定(四)Y马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理，定量的测定微量蛋白 浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华 力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律Beers law)。此染料 与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定 595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可 稳定lh,之后，蛋白质一染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质一染料复合物具有很高 的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5卩L/ml时就有 0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10100卩g蛋白质，微量测定法 测定范围是1 10卩g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白 质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多 染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研究表明：NaCl, KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。强碱缓 冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2 巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100, SDS，玻璃去污剂有少量 颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不 易消除。试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释 至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V)乙醇。二、标准和待测蛋白质溶液1标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用 0.15mol/LNaCl 配制成 1mg/ml， 0.1mg/ml 蛋白溶液。2未知蛋白质溶液。三、器材试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml）, UV2000型分光光度计。操作方法一、标准法制定标准曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 表a试管编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5 ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色595nm二、微量法制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。试管编号0123451mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5 ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色595nm三、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所 测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质 浓度（ mg/ml）。注意事项（1）（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5 20min内测定光吸收，因为 在这段时间内颜色是最稳定的。（2）（2） 测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复 合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。思考题：根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度(1)(1) 样品不易溶解，但要求结果较准确。(2)(2) 要求在半天内测定 60 个样品。3) 要求很迅速地测定一系列试管(30 支)中溶液的蛋白质浓度。实验三、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度目的要求1、学会蛋白质含量的测定方法。2、掌握该测定方法的基本原理和优缺点。原理考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理。 考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由 红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内， 蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer law)，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的 增加量得到与其结合的蛋白质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应 完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h 左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。 蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液 中含蛋白质5yg/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为 10-100隧蛋白质，微量测定法测定范围是1-10隧蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线 性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱 有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测 定。此方法干扰物少，研究表明:NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4不干扰测定。强碱 性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、乙酸、 %巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂(如Triton X-100, SDS)和玻璃去污剂均 有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太 大而不易消除。由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。试剂和器材1 试剂(1) 标准蛋白质溶液结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白 OD 11c%m=6.6 测定蛋白质含量，再用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL， 0.1 mg/mL 蛋白溶液。(2) 考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀 释至1000 mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇， 8.5%(W/V)磷酸。2. 待测样品未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为0.1-5 mg/mL，若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl 溶液适当稀释。3器材(1) 722 型分光光度计(2) 微量进样器移液管(0.1 mL及5 mL)(4)试管及试管架3操作方法1 标准法制作标准曲线取 14 支试管，分两组按下表平行操作。试管编号0123456标准蛋白含量(pg)01020304050601 mg/mL标准蛋白溶液(mL)00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl (mL)0.100.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂(mL)5 mL摇匀，1 h 内以 0 号试管为空白对照，在 595nm 处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。2微量法制作标准曲线取 12 支试管，分两组按下表平行操作。试管篇号012345标准蛋白含量(pg)0135790.1 mg/mL标准蛋白 溶液(mL)00.010.030.050.070.090.15 mol/L NaCl(mL)0.100.090.070.050.030.01考马斯亮蓝试剂(mL)1 mL摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595 nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 3未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所 测定的 OD595nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋 白质浓度(mg/mL)。4注意事项(1)如果测定要求很严格，可以再试剂加入后的5-20 min 内测定光吸收，因为再这段 时间内颜色最稳定。(2)测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可 以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。思考题1. 请详究考马斯亮蓝与蛋白质的呈色原理。如何进行蛋白质的定量测定。2. 采用该法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？作为标准蛋 白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。3. 使用分光光度计时，比色皿对所测样品的结果有无影响，该怎样处理？1. 常规染色脱色方法：a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色 1 小时或更长时间。 注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高， 则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色 充分。染色 2-4 个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少 2-3 次。d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。注：脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙 酸，50%蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色 4-24 小时。期间更换脱色液 2-4 次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋 白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色 1-2 小时后即可出现。注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带 的颜色变浅。f. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含 20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。2. 快速染色脱色方法：a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 通常对于胶浓度大于 10%的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于 10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶 碎裂的情况。b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动 5-10 分钟。c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少 2-3 次。d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。注：脱色液可以选购碧云天的考马斯亮蓝染色脱色液(P0017C)；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙 酸，50%蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动 5-10 分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f,直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含 20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。常见问题:1. 常规染色脱色方法和快速染色脱色方法的优缺点？常规染色脱色方法耗时较长，但检测灵敏度更高，染色效果更加稳定。快速染色脱色方法通常检测灵敏度略低，并且在微波炉 加热的过程中有时会出现暴沸导致凝胶碎裂的情况，需特别注意。另外微波炉加热导致的高温会引起染色液和脱色液中的乙酸 的挥发，最好能在通风橱中进行。考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液 Commassie Blue Fast Staining Solution包装：Cat.No产品名称规格价格WB021考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液100ml35.00WB021250ml70.00WB021500ml130.00产品简介：考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast Staining Solution)是以考马斯亮蓝R-250为染料配制而成的染色液，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE蛋白电泳胶的快 速染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。考马斯亮蓝快速染色液采取新配方，超薄胶只需染色10分钟，就可以显示出清晰的 蛋白电泳条带；检测到低达10ng的蛋白电泳条带。无需对蛋白和凝胶进行固定，无需脱色，操作更加简单。本考马斯亮蓝快速染色液是一种无毒，无刺激性气味的高度环保型染色液。普通的常 规方法需使用剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸，而本公司生产的考马斯亮蓝快速染色液则 采取全新配方，实现了无毒和无刺激性气味。本染色液和质谱分析兼容，即经过本染色液染色的蛋白条带或蛋白点可以用于后续的 质谱分析。贮存：室温密封保存使用说明1. 洗涤 电泳结束后，将凝胶剥离玻璃板，放入烧杯或塑料盒中，加入100ml的蒸馏水。 煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持 1 分钟，弃水。2. 染色 倒入适量染色液，煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持2 分钟；如果胶非常厚， 染色的时间需适当延长。注：在微波炉中适当加热，可以大大加快染色速度。加热时，敞开容器口，容器尽量大 些 ，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。3. 脱色 到掉染色液（可以回收重复使用），加入适量水，煮沸或微波炉中加热至沸腾， 维持 2分钟；如果胶非常厚，脱色的时间需适当延长。也可换水34次，至背景无色4. 扫描或拍照记录注意事项：1. 本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。2. 如果使用微波炉加热，敞开容器口，容器尽量大些，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎 裂。如果时间不是特别紧急，推荐按照常规方法进行：洗涤3 次，每次摇床摇晃5 分钟 f染色12小时f脱色到出现清晰条带。常见问题：1. 无染色条带：可能SDS未除尽、染色时间过短或上样量太少，建议电泳时加适当量 的 BSA 等作为阳性对照。2. 背景太高：可能 SDS 等杂质没有除尽，建议延长洗涤时间或增加洗涤次数。5. 考马斯亮蓝染色这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为0.1聘的蛋白。通常可以根据所需要 的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。 戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上，将凝胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝 （20ml已经足够）的容器内（小心不要将胶撕破）。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直 至凝胶脱落。 对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢震荡5分钟10分钟，对于1.5mm的凝胶， 则需10分钟20分钟，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。弃去染液，将 凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。加入考马斯亮蓝脱色液（约50ml），清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需 要1h,使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。