蛋白质定量

实验六 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝 G250 法)一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量 分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临 床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝 G 250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较 好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光 度计的结构、原理和在比色法中的应用。二、原理考马斯亮蓝G250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。 蛋白质含量在01000p g范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量 成正比，故可用比色法测定。三、仪器、试剂和材料1仪器(1)分析天平(2) 具塞刻度试管10mlX 8(3) 吸管 0.1mlXI, lmlXZ, 5mlXI( 4)研钵( 5)漏斗(6) 离心管10ml(7) 容量瓶10ml( 8)离心机( 9) 721 型分光光度计2试剂(1) 标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100m 1,制 成 100 pgml 的原液。(2) 考马斯亮蓝G250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G250,溶于50ml 90% 乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100m 1,最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液在常温下可放置一个月。3材料绿豆芽四、操作步骤1标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。操作项目管号123456标准蛋白质溶液(ml)00.20.40. 60.81.0蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20G-250 试剂(ml)各5蛋白质含量(p g)020406080100盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在1 h内完成）。 以牛血清白蛋白含量（|J g）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。2样品中蛋白质含量的测定（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀 浆，离心（4000r / min, lOmin）,将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水, 悬浮后再离心10m in,合并上清液，定客至刻度。（ 2）另取 1 支具塞试管，准确加入 0.l ml 样品提取液，再加入 0.9 ml 蒸馏水， 5ml 考 马斯亮蓝G250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm 波长下比色，记录吸光度。五、结果处理根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（M g），按下式 计算：样品蛋白质含量（M g/g鲜重）=（查得的蛋白质含量（M g） X提取液总体积（ml） /（样品鲜重（g）X测定时取用提取液的体积（ml）六、注意事项比色应在出现蓝色2 minl h内完成。七、思考题1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？ 2如何正确使用分光光度计？参考文献鲁子贤。蛋白质化学。北京：科学出版社， 1981 文树基。基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社， 1994 张龙翔.生物化学实验技术。北京：人民教育出版社， 1981