电泳常见问题解答

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDS PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 TrisHCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用 的Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此 甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很 高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度， 压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离 胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增 加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作 用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以， pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排 除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处 理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT （或Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白 相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种 方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min， 再离心加样。2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用 可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸 胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液 中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只 用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不 可作为测定分子量来使用。3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝 固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择trisHCL系统，TEMED与AP： AP提供自由基，TEMED是催化剂， 催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子 去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待 凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般 凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染 料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技 术手册P82-103。5. “ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的 凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙 气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品 促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。9. 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道 顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离 的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子 量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同 的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙 醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未 跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正 确（6.7）；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包 括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比 如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者 主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的 夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在 30MIN-1H 内凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED， APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被 氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此 时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓 冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强 度太高。我们实验室的传统也是将倒完的胶放在冰箱内过夜凝聚，第二天跑胶 效果非常好。我想主要原因并不在于低温，而在于过夜时间长，让胶 凝聚得非常充分而且均匀。反之，在37 温箱内虽然凝得很快，但是 容易出现胶脆，凝聚不均匀等情况。我想只要你得配液没问题，那么 适当延长凝胶时间肯定效果会好些！ 温度的高低决定了胶聚合的速度：高温有助于胶的聚合。但是，胶聚 合得越快，其脆性也越大。因此，一般把胶的聚合时间控制在 40-60 分钟左右为宜。当然，灌胶后放入4 度聚合，其聚合时间会大大延长， 但是其脆性也会大大降低上层的浓缩胶用的是Tris-HCL缓冲液，PH6.8，HCL的解离度大， 几乎全部成 CL-，CL-在电场中移动最快。而电泳槽中含有甘氨酸，在PH6.8时只有少 量解离，在电场中移动的最慢。蛋白质（被夹在中间）就在由快慢离子形成的电位梯度中被浓缩了。下层的分离胶用的是Tris-甘氨酸缓冲液，PH8.8，在此PH下，甘 氨酸解离度增大， 泳动速度增加并超过了蛋白质，原先的电位梯度消失，大小形状不同 的蛋白质在电场中分离。电泳结果的好坏肯定和电泳的条件有关,我认为应该注意以下几点: 1,样品的纯度高,杂质含量少,选择的 Loading 要正确;2, 就是胶的浓度要控制好,看你跑的条带大小来选择胶的浓度,特别是 分离胶的浓度!3, 就是电压的选择,当样品在浓缩胶里时,可以把电压调小点,当到分离 胶时,电压可以加大,这样跑的条带就清晰!4, 点样品的量要控制好 ,不能太多,否则就跑成团状,也不能太少,条带 不清晰!至于样品和 Marker 显色问题,那要看你用的 Marker 是预染 Marker 还 是非预染Marker,如果用的是预染Marker那就是跑胶时Marker条带 先显现出来!如果是非预染Marker那条带就和样品一起染色时显现出 来!SDS-PAGE经验集锦：极其好用2009-06-28 00:17蛋白SDS-PAGE电 泳及定量在蛋白质技术手册5基础上，根据实验条件的方便修改。 请仔细看各种细节改良，各种操作效果经本实验室5 年验证。【一】 储存液配制(注意配方和实际测定参数！)(1) 2 M Tris-HCl (实测 pH 8.9土0.1, 25C) 500 mL： 121 g Tris base 加350 mL双蒸水溶解，以玻璃棒搅拌约1 min,缓慢加入浓盐酸(11.8 M) 20 mL，继续搅拌均匀，并使Tris全部溶解，溶液澄清，加入适 量双蒸水至500 mL,倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱保存。(2)100 g/L SDS 溶液： 10 g SDS (要求高纯度，其质量明显影响 电泳效果)加100 mL双蒸水，于洁净的250 mL烧杯中进行微波加 热溶解，注意不要爆沸，间歇用玻璃棒搅拌以加速溶解，完全溶解后 的溶液应清澈透明无色。倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱保存。冰 箱取出后可微波加热促进储存液的溶化。(3) 75% (v/v)甘油：于500 mL量筒中倒入分析纯甘油300 mL, 加双蒸水100 mL，以一次性塑料手套封口，颠倒量筒使甘油完全溶 解，然后倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱保存。(4) 10 g/L溴酚蓝溶液：500 mg溴酚蓝加双蒸水50 mL，搅拌溶解， 倒入棕色玻璃试剂瓶中，4 C冰箱保存。不用过滤。用时注意吸取上 层澄清液，不要吸到沉淀。【二】电泳工作液配制(省劲好用！)(1) Acr-Bis液(丙烯酰胺溶液)500 mL：于800 mL洁净的烧杯中， 依次称取双丙烯酰胺4 g,丙烯酰胺146 g，缓慢倒入双蒸水约350 mL， 以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中， 所以要称重时注意周围空气流速，称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双 丙烯酰胺掩盖。玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺 浮起并扩散到空气中。完全溶解的溶液应清澈无色透明。待溶解完全 后补加双蒸水至500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱可保存10 个月。(2) 4X分离胶缓冲液，500 mL：于500 mL洁净的量筒中，依次加入 375 mL 2 M Tris-HCl (实测 pH 8.9土0.1, 25C),100 g/L SDS 溶液(冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化)20 mL,最后加入适 量双蒸水至500 mL。倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱最少可保存12 个月。有时冰箱温度过低会使储存液混浊,微波略微加热使其澄清后 即可使用。(3) 100 g/L 过硫酸铵溶液(ammonium persulfate, AP)20 mL： 2g 过 硫酸铵加20 mL双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中，4C冰箱最少可保 存10个月。注意配胶时不要交叉污染TEMED，可以以5 mL分装到 4 个无色塑料试剂瓶中分别保存。(4) TEMED成品液：购买后分装成2或5 mL小管装使用可避免母 液受到污染。(5) 5X样品缓冲液，100 mL:依次加入50 mL 75% (v/v)甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液， 10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液， 5 mL 2 M Tris-HCl (实测 pH8.9土0.1，25C)，5 mL 巯基乙醇，9 mL 双蒸水。混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱至少可保存12个月。可分 装成 10 mL 使用，不会使母液受到蛋白污染。(6) 10X 电泳缓冲液，1000 mL： 称取 10 g SDS，30 g Tris base，144g 甘氨酸(事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色 的产品)于1000 mL的烧杯中，加水约700 mL溶解，可微波炉加热( 80C )以促进溶解，注意不要使其沸腾，加热至烧杯烫手即可， 间歇用玻璃棒搅拌。分装至无色玻璃试剂瓶中，室温最少可保存6个 月。其pH值约为pH 8.4土0.1。【注意可省去pH6.8的浓缩胶缓冲液，用4X分离胶缓冲液pH8.9的 替代即可】【三】12% 电泳胶的配制 要注意的是，配胶时分离胶的五个组分按下表依次加入洁净的配制分 离胶的小烧杯内，以枪头搅拌约10-20 sec,灌胶后再在胶面上小心地 铺上一几毫米厚的水层（这可使凝固后的胶面平滑整齐），然后于37C 凝固15-30 min。而在配胶时浓缩胶只加前三个组分，混合液要于4C 冰箱保存，待分离胶凝固后再取出加入AP和TEMED溶液，枪头搅 拌均匀，灌胶后插入梳子，然后于37C凝固15-30 min。凝固的胶连 带其附着的玻璃板用塑料薄膜严密包裹可在4C冰箱保存2-4天，长 时间保存易干胶，要重新做胶。12.5%电泳胶的配制（10mL）Table 12.5% Gel componentsReagentsCondensing gel二块30% Acr-Bis solution0.67 mL4xseperating gel buffer 2.5 mL pH8.9H2O3.5 mL50 yL100 g/L APSeperating gel4 mL1 mL pH8.92.3 mL30yLTEMED5yL4块30% Acr-Bis solution8 mL1.35 mL4xseperating gel buffer5 mL pH8.92mLpH8.9H2O7 mL4.6 mL100 g/L AP100 yL60 yLTEMED10 yL10 yL六块30% Acr-Bis solution12 mL2.1 mL4xseperating gel buffer7.5 mL pH8.93mL pH8.9H2O10.5 mL7mL100 g/L AP150 yL90 yLTEMED15yL15yL其他浓度的电泳胶配制A% 电泳胶的配制（10 mL）Table A% Gel components（10 mL）ReagentsSeperating gelCondensing gel二块30% Acr-Bis solution0.67 mL4xseperating gel buffer1 mL pH8.9H2O2.3 mL100 g/L AP30 pLTEMED5 pL ( A% *10mL ) /30% mL2.5 mL pH8.9补 足 10mL50 pL5 pL其中的H2O补足10mL，所用的计算公式为:10mL-2.5mL- (A% *10mL)/30% mL 。 例如 6%的配方中，30% Acr-Bis solution2 mLH2O5.5 mL例如 12.5%的配方中，30% Acr-Bis solution 4 mLH2O3.5 mL例如 15%的配方中，30% Acr-Bis solution 5 mLH2O2.5 mL【四】 考马斯亮蓝染色和脱色（极其好用！） 考马斯亮蓝染色液 1000 mL：先称取考马斯亮蓝R250 1.0 g 于1000 mL试剂瓶内，加入甲醇 450mL溶解，再加冰醋酸100 mL和双蒸水450 mL至大约1000 mL。 室温可放置12个月以上。染色液可倒入专用的回收试剂瓶，届时加 入适量甲醇、考马斯亮蓝和大约10 g/L的三氯乙酸后可重复使用。 考马斯亮蓝脱色液 10 L：于10 L洁净塑料桶内装入工业乙醇2 L,冰醋酸500 mL，加入去离 子水至10 L，混匀，室温可放置12个月以上。蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色： 凝胶的染色和脱色于合适体积的微波炉盒中进行。电泳后的凝胶加入 染色液（以刚没过凝胶即可），于微波炉加热约40-70 sec至染色液刚 刚沸腾（注意塑料盒的盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸出），然后 于脱色摇床上继续染色约 10 min 即可。染色液请倒入专用的回收容 器内。以自来水小心地淋洗凝胶冲去剩余染料，然后倒入适量的脱色 液，微波加热至刚沸腾后于染色摇床上摇动约10 min,倒掉脱色液， 此时凝胶的蛋白条带即可看清。重复以上脱色步骤一次，即可看清电 泳条带。扫描凝胶蛋白条带需要完全脱掉背景颜色，这需要重新换上 脱色液室温摇床脱色 2 h 以上。【五】 蛋白上样量的选择 要根据具体情况决定，对于考马斯亮蓝染色，如果样品为菌体蛋白样 品，有至少50条以上的条带要显出来，需要上样量在15 p g左右即 可，如果蛋白条带少于 6 条，如蛋白 Marker 或纯化阶段后期的蛋白 样品，上样量可减少至 2 p g 即可显出清晰的条带。【简化成大肠杆菌上样，大约等于5.0个OD600上样10-15 uL左右】 【本内容由华东理工大学鲁华生物技术研究所提供，尊重作者劳动成 果，转帖请注明】