幽门螺杆菌超氧化物歧化酶基因克隆 表达及多克隆抗体制备

郑 州 大 学 2 0 09 届 硕 士研 究 生 论 文幽 门螺 杆 菌 so d 基 因克 隆 表 达 及 多 克 隆 抗 体 制 备C lo n e-ex P ressio n a n d P reP a ra tio n o f P o lyelo n al a n tib o d y o f石几价 口吞a c ter 刀 )lo ri s o d g e n ePo stg ra d u a te劝 a n g Ji a n g u a n gS u P e rv iso rP r o f.D u a n G u a n g e a iD eP a rt m e n t o f E P id e m io lo gy C o lle g e o f Pu b lic H e a lthZ h en gZ h o u U ul v er sityZh e n gZ h o u ，H e n a n ，4 5 0 0 5 1A B S T R A C TIt 15 k o n w n that C yto to x in 一 asso ciated g en e A (C agA ) 15 o n e o f the m o st im po rtan t virulen ce faetor o f H .P ylo ri. Td forth er stud y o n the b io lo gieal fun etion o f C agA ，Th e researe h gro uP o f H .P y lori in Zh en gZ h o u u niv ersity eo n stru eted C agAn eg ativ em u tan ts一HP 2 7 eagAv iah om o lo go u s reeo m b in atio n . S o m ed iffe ren t允n etio n al P rotein o f H .P y lo ri related w ith C agA w as sere en ed o u t an d id en tified b y co m P ari n g the b io lo gical P roP ert y o f wi ld strain s an d m u tan s w ith the aid o f p ro te o m ie s m e th o d s . O n e o f S o m e d if l七re nt f u n c ti o n a l P ro te in 15 su P e ro x id ed ism u tase (S O D ) P rotein . Th e stud y o n th e relatio n shiP o f S O D w ith C agA 15 n o tr eP o r te d y e t. T h e f irst im P o r ta n t t h in g 15 to e o n st ru e t P o ly c lo n a l a n tib o d y o f S O D ，a n d th en eo n firm that it 15 d iffe ren t o f the estab lish m en t o f S O D b etw een w ild an d C agA d e le te d m u ta n t s.M e th o d s :1. 于叮get gene w as elon ed b y P C R an d it w as throu gh P rim er P rim ier 5 .0 systern th att h e P r im e rs w a s d e sig e n d .2 . Th e am P lified g en e fra g llen t w ere c o n n ec ted wi th v ec to r P M D 19 一T， an dt ra n s f o n lle d in io D H 5 a .3 . D o ub le d ig e stio n w ith N d e l 、乃 0 1 re stri ctio n en d o nu e le as e ，th e targ et fra gln en tW ere co tm ected w ith P E T 3 0 (a) an d tran sform ed in to B L Z I.4 .肠 吧 以 p r o te in w a s P u r if ie d b y N i一N T Ae o lu n 匡n a c co r d in g to t h eo f t he f u sio n P r o te in w it h w it h 6 x H is 一ta g a f fi n i ty .Th e P uri fied fusio n S O D P rotein as an tigen w as injeCt ed in to rab b it.T h e tite r o f th e P o ly e lo n a l a n tise rumw a s m e a sured b y t he m e th o d s o f E L IS A .犷郑 州 大 学 2以)9 届 硕 士 研 究 生 论 文幽 门螺杆 菌 s od 基 因 克 隆一表 达 及 多克 隆抗 体 制 备R e S U l ts :1 .S o d g en e fra gm ent w as am P lified b y us in g total D N A o f H P 2 7 as the tel旧P late . 2 .A f te r a l刀P li fi 目p r o d u c ts w a s P u r if ie da n d c o n e d e d ， c o l m e ct 曰w i thv e c t orP M D 19 一T，an d the tral招伪彻 ed inio D H S 屯 the reco m b in ant P lasrnid P M D 19 一so dw a s c o n s七u c te d .3 .M 阳 g o t t h e h e r e c o m b i na ntP la sm id P E T 3 0 一so d c o n f ir m e d b y D N Ase q u e nc ean alysi s.4 .Th e fus io n Pro td n wi th 6 x H is一ta g a ffi nity w as go t via affi nity chro m ato graP h y.5 .T h e t it er o f t h e p o ly c lo n a l a n tise ru 幻。w a s rn o re t h a n l :3 2 0 0 ，it m e a nt t he s u e e e s so f t h e P r印 肚 滋io n o f p o ly e lo n a l a n tise l”rn .C o n c IU Sio n :1 .S o d g e n e f ra 罗 明 n t c ou ld b e e lo n e d f iom H P 2 7 f or t he f ir st tim e .2 .R ecomb i五ant Plasm id p E T 3o 一so d w as 访du eed to e却 ress.Th e stud ies su 路 est thatt h e s u ita b le in d u e e rn e n t e o n d it io n w a s 0 .l rn 们n o 功 IP T G f o r 4 .5 h o u r s .3 .Th e so lub ility an alys is sh o w s that m o st o f the fusio n P ro te in s o f S O D ex ists asso lub le P rotd n an d the ex P ressio n 15 mu ch high er m easure d b y S D S 一PA G E .4 .A 刀tisen 刀n w ith h igh titer eould b e Ob tain ed in r戒)bit in u n u nized b y P 丽 fiedf u sio n S O D P r o te in . T h e s e w o r k w ill la y a f o u n d a tio n f o r f u r th e r st ud y o n so dp ro te in .K ey w ords:H .P ylori ;sod gen e;clon e;ex Pression ;an tibody郑 州 大 学 2( X)9 届 硕 士 研 究 生 论 文幽门螺杆菌 sod 基因克陇 体现及多克隆抗体制备论 文 缩 写 词 中 英 文 对 照别旧p田刀p ic iU i n氨 节 青 霉 素如b a se P a i r碱 基 对B S AB o v in e 别，u 力。a 】b u m i n牛 血 清 白蛋 白C agAC yto tox in一asso d ated g en e A细 胞 毒 素 相 关 基 因 A 蛋 白D 8D a lt0 D道 尔 顿D N AD eox州 bo nuc ld c 翻 d脱 氧 核 糖 核 酸d N T Pd eox 州 bo n uc leo side tripo sPh ate脱 氧 核 糖 核 昔 三 磷 酸E D T AE thylene diam inetera aeetic 翻 d乙 二 胺 四 乙 酸g( 行田旧克hh O U r小 时H .P ylo riH elico b aeter Pyl ori幽 门螺 杆 菌IP T GisoP roP y lthio 一p 一D 一g alaetosid e异 丙 基 一p一D 一半 乳 糖 昔L BL u r ia 一B e r ta n i细 菌 用 液 体 培 养 基K D儿 10 D a lto n千 道 尔 顿m l刀m i nu te分 钟m lM illilite r毫 升O D御 石cal d en sity光 密 度O R Fq 阵n rea din g 丘习m e开 放 阅 读 框P A G EP o ly a 卿 la m id e g e l e le c t ro P h o n 治15聚 丙 烯 酞 胺 凝 胶 电泳P B SPh o sPh ate bu 佰改ed saline磷 酸 盐 缓 冲 液P C Rp o ly m e ra se c h a in r ea c t io n多 聚 酶 链 式 反 应R O Sr ea c ti v e o x y g e n s P e d e s活 性 氧 簇Ts知rs!sirCempsDr ev o lu it o n p e r m i nu te每 分 钟 转 速S e c o n d 秒sod ium d od ecyl sul fate 十二 烷 基 硫 酸 钠S u p e ro x id e d is m u ta se 超 氧 化 物 岐 化 酶 tris h y drox ym eth贝 一a们nln om eth an e 三 轻 甲 基 氨 基 甲烷 m 1C ro g 旧m 微 克m ic ro lite r 微 升七目 录1 前 言 二“”“”“”.“”“”“ ”.”.“.”.“”二”.“”.”“.”.”.”.“.”“”.12 材 料 与 方 法 .“.“二“”.“:. ”.“”二”“”.“”“”“”.“”二”.”二“”“”“.52 .1 实 验 材 料 .，.52.2 试 验 方 法 . 103 结 果 与 分 析 .”.”.“二”二“”“二“.”二“.”.”.“”“”“”.“”.”.“.213 .1 幽 门 螺 杆 菌 Hl，27 总 D N A 的提 取 .213 2幽 门螺 杆 菌 HF 27 的过 氧 化 物 歧 化 酶 (soD ) 基 因 的 P C R 扩 增 及 鉴 定 .”.213.3 P C R 扩 增 产 物 酶 切 鉴 定 .n3 .4 P C R 扩 增 产 物 的 凝 胶 纯 化 回 收 结 果 ，.“.223 .5 重 组 质 粒 PM D 19一s0 D 的 构 建 、 筛 选 及 鉴 定 结 果 .，.，.233 .6 重 组 质 粒 PET 3 0一s0 D 的构 建 及 鉴 定 二”.，.、.2 63 .7目的 蛋 白 的 时 间 优 化 诱 导 表 达 .283 .8目的 蛋 白 的 IPT G 浓 度 优 化 诱 导 表 达 .，.281 9目的 蛋 白 的 可 溶 性 分 析 .，.，二2 93 .10 目的 蛋 白 的 N l一 TA 柱 层 析 纯 化 结 果 .，.303 .11 免 疫 血 清 效 价 测 定 .，.，.，二 .，.，.，.，.304 讨 论 与 结 论 . “.”“”:.“.“”二”“.”.“.”二”“”.“”.”二“.“.”.”“”.”“”.“.314 .1 关 于 P C R 扩 增 s0 D 基 因 时 ， 引 物 设 计 的 几 个 问题 .314 .2 PE T 3 0()载 体 .，.，.，.324.3 酶 切 位 点 与 PM D 19一 载 体 以及 及 蓝 白斑 筛 选 .，.，.324.4 S D S 一聚 丙 烯 酞 胺 凝 胶 电泳 .334.5 N l.N T A 柱 亲 和 层 析 纯 化 含 H is 标 签 的 目的 蛋 白 .，.344.6 融 合 蛋 白 的 表 达 及 多 克 隆 抗 体 血 清 的 制 备 .，.，.344.7 结 论 .，.一.，.，.，.，二，.一 “.3 5参 考 文 献43 n6 U后记 .“”.”.”“.”.”二”“”“二“.”二“.“.”.“.“”.“二“.“.“”二”.”.“.“.“”.“:综 述”“. .“”“.”“”.”“”.“”.“”“”“.“.”.“”“”. .“”“”“.”“”4 1郑 州 大 学 2( X)9 届 硕 士 研 究 生 论 文幽 门螺 杆 菌 so d 基 因克 隆 表 达 及 多 克 隆抗 体 制 备幽 门螺 杆 菌 so d 基 因 克 隆- 表 达 及 多 克 隆抗 体 制 备 硕 士 研 究 生张 建 光导师段 广 才郑 州 大 学 公 共 卫 生 学 院流 行 病 学 教 研 室郑 州4 500011启份 吉1口 叮 万幽 门螺 杆 菌 (H eli cob acter nyl ori，H. p 尹ori ) 是 一 种 可 长 期 定 植 于 人 类 胃粘 膜 的 革 兰 氏 阴 性 螺 旋 形 微 需 氧 菌 ，在 全 世 界 范 围 内感 染 率 超 过 50 % 。 自 1984 年 M 别rsh all 和 w 首 次 发 现 该 菌 以来 ，H. p 贝ori 被 认 为 是 慢 性 活 动 性 胃炎 的 病 原 体 ，H .p 尹ori 感 染 是 消 化 性 溃 疡 、 胃癌 和 胃粘 膜 相 关淋 巴组 织 瘤 的重 要 危 险 因素【7，3 ，4。来 自世 界 各 地 的流 行 病 研 究 证 实 ，H. p 贝。ri 与 胃癌 有 关 ，世 界 卫 生 组 织 已将 其 列 为 一 类 致 癌 源 【5，6，71。目前 ，H. P 贝ori 作 为 致 病 因 子 的特 点 虽 已得 到 公 认 ，但 有 关 其 致 病 的 分 子 机 制 及 感 染 结 局 多 样 性 的 本 质 仍 未 阐 明 。细 胞 毒 素 相 关 基 因 A 蛋 白细 胞 毒 素 相 关 基 因 A 蛋 白(C ytotox in 一 assoe iated gen eA ，C a幼 )是 H. p 尹。ri 重 要 的 毒 力 因 子 之一 181。通 常 根 据 该 蛋 白的 有 无 ，将 H. p ylori 分 成 两 型 : I 型 为 高 毒 力 株 ，含 cagA 基 因 ，表 达 C agA 和 v acA 蛋 白 ，具 有 空 泡 毒 素 活 性 ; n 型 为 低 毒 力 株 ，不 含 cagA基 因 ，不 表 达 c agA 和 v acA 蛋 白 ，无 空 泡 毒 素 活 性 9l。流 行 病 学 研 究 发 现 ，H .p ylori I 型 菌 株 与 十 二 指 肠 溃 疡 和 胃 癌 等 严 重 胃 肠 疾 病 的 发 生 有 关 ，提 示 C agA 蛋 白可 能 与 H. p 贝。ri 的 致 病 作 用 存 在 关 联 10，1，2。 c agA蛋 白 可 经 cag 致 病 岛 (cagp ath o geni d ty isl and ，ca罗 AI )编 码 的 W 型 分 泌 系 统 注 入 宿 主 细 胞 ，通 过 依 赖 磷 酸 化 和 (或 ) 独 立 于 磷 酸 化 的机 制 ，与 宿 主 细 胞 涉 及 调 控 细 胞 生 长 和 运 动 的 多种 蛋 白相 互 作 用 ，导 致 细 胞 功 能 异 常 l”，4】。分 析 H. p 尹。ri感 染 引起 极 化 的 单 层 上 皮 细胞 基 因 水 平 的 表 达 变 化 ， 发 现 超 过 90% 的 受 影 响 基 因 依 赖 于 cag 致 病 岛 的 作 用 ， 而 在 依 赖 于 cag 致 病 岛 的 基 因 中有 79 % 与 cagA 有 关 l习。 因 此 ，c agA 可 能 是 一 种 重 要 的 疾 病 相 关 蛋 白 ，在 H .p 贝。ri致 病 过 程 中 发 挥 关 键 作 用 ，进 一 步 研 究 c agA 蛋 白 的 生 物 学 功 能 及 其 参 与 H. p ylori 致 病 的 机 制 ，对 于 揭 示 H. p 贝ori 复 杂 的 致 病郑 州 大 学 2 ( X)9 届 硕 士 研 究 生 论 文 幽 门螺 杆 菌 so d 基 因 克 隆 表 达 及 多 克 隆 抗 体 制 备效 应 的本 质 及 阐 明其 致 癌 的分 子 机 制 具 有 重 要 意 义 。而 在 自然 情 况 下 ， 由于 H. 州 ori 自身 的变 异 ，比幼 基 因 阴性 菌 株 与 cagA 基 因 阳 性 菌 株 之 间缺 乏 相 同 的 遗 传 背 景 ，二 者 之 间 比较 的 结 果 可 能 是 多 种 基 因 功 能 差 异 的 综 合 作 用 ，所 以无 法 对 份幼 基 因 功 能 做 出真 实判 断 【6，17，8】。基 于 此 情 况 ， 郑 州 大 学 公共 卫 生 学 院博 士 生 黄 志 刚等 【9利 用 同源 重 组 技 术 ，构 建 了 份幼 基 因 敲 除 突 变 株 (H p27 cagA ) ，通 过 比较 遗 传 背 景 相 同 的野 生 株 与 突 变 株 生 物 学 特 性 差 异 以及 利 用 蛋 白质 组 学 方 法 对 其 菌 体 蛋 白表 达 差 异 的 分 析 ，筛 选 和 鉴 定 出 与 ca gA 基 因 相 关 的 H. p 贝ori 功 能 蛋 白 ，为 丰 富 cagA 基 因 功 能 的研 究 内容 ，揭 示C agA 在 H. p 尹ori 致 病 中 的 分 子 机 制 ，探 索 其 与 胃癌 的相 关 性 提 供 重 要 依 据 。其 中 S O D 为 突 变 株 与 野 生 株 菌 体 表 达 差 异 蛋 白之 一 。超 氧 化 物 歧 化 酶 (S0 功 是 普 遍 存 在 于 生 物 体 内 的 能 清 除 超 氧 阴 离 子 自 由基 的 一 类 金 属 酶 ， 由 M cC ord 和 F rido vich 首 先 从 牛 血 红 细 胞 中 分 离 得 到 。按 其 结 合 的 金 属 离 子 的 不 同 ， 主 要 可 分 为 e u ，z n 一s o n ，枷 一s o n 和 F e-s o n 3 种 120 。 C u ，Z n 一 S O D 主 要 存 在 于 真 核 生 物 细 胞 中 。M n 一S O D 主 要 存 在 原 核 生 物 和 真 核 生 物 的线 粒 体 中 ，在 高 等 植 物 中 的过 氧 化 物 酶 体 中也含 有 。F e一S O D 主 要 存 在 于 原 核 生 物 和 某 些 植 物 的 叶 绿 体 中 。除 了 以上 这 3 种 酶 ，幻 m 发 现 在 S tr印tom yc essP .IM S N U 一I 中 存 在 一 种 新 的 s O D ，是 以 N i 作 为 金 属 辅 基 。此 外 ，在 s.co eli co to:中有 报 道 存 在 性 质 类 似 于 F e-s o D 的 F 咙 n s o D1 2，1。本 试 验 基 于 郑 州大 学 公共 卫 生 学 院 黄 志 刚 博 士 对 cagA 基 因 敲 除 H p 27 突 变 株 与 野 生 株 在 蛋 白质 组 学 研 究 中 得 出 的 菌 体 表 达 差 异 蛋 白 ，通 过 肤 指 纹 图 谱 的 M ascot 检 索 ，利 用 蛋 白质 数 据 库 N e e x 网站 (httP :仰 拍sp ector.u csf 咖 ) 22提 供 的程 序 M s 一五t 进 行 数 据 库 检 索 而鉴 定 表 达 差 异 蛋 白 。其 中 之 一 与 F e 一s oD 911 23 1349 0肤 段 匹配 率 为 62 % ，质 谱打 分 为 132 。根 据 M S 一fit 先 假 设 肤 段 的 匹 配 是 随 机 事 件 ， 计 算 匹 配 率 ， 设 定 检 验 水 准 为 0.05 ，P 0.05 ，则 可 认 为 该 事 件 不 是 随 机 事 件 ，其 结 论 在 统 计 学 上 是 可 信 的 。 因 此 可 以认 为 该 差 异 蛋 白为 Fe 一s o D 。不 同 生 物 来 源 的 Fe 一s o D 一 级 结 构 同 一 性 较 低 ，P h algun 等 23比较 了 7 种 嗜 盐 古 细 菌 家 族 的 Fe 一S O D. 在 199 个 氨 基 酸 中有 125 个 氨 基 酸 完 全 一 致 (62 % ).而 它 们 与 真 菌 和 真 核 线 粒 体 F e-S O D 相 比只 有 35 % 一 40 % 的 同一 性 。但 D on atella等 241研 究 了真 核 细 胞 Te lrah ym en a p 州 form is 的 四 聚 体 F e-s o D ，并 测 序 、氨 基 酸 序 列 分 析 表 明 ， 与 其 它 来 源 的 F e一S o D 相 比 ， 具 有 较 低 的 同源 性 (33 % 一 34 % )。郑 州 大 学 2( X)9 届 硕 士 研 究 生 论 文幽 门螺 杆 菌 s od 基 因 克 隆一表 达 及 多 克 隆 抗 体 制 备B 娜 等 t25认 为 对 F e-s oD 结 构 最 有 意 义 的特 征 之 一 是 高度 保 守 的 芳 香 族 氨 基 酸 含 量 ，特 别 是 在 活 性 部 位 的 氨 基 酸 残 基 。 占 17% 的 蛋 白序 列 的 33 个 保 守 氨 基 酸 残 基 分 别 是 H is，Tyr ，P he 和 Trp ， 活 性 部 位 F e 的 8A 。范 围 内发 现 5 个 保 守 氨 基 酸 残 基 ，分 别 为 T 班34 ，T yr7 7 ，H is3o ，T 印 12 3 和 T 印 158 ，其 中 ， 一 对 T 印 和T yr3 4 存 在 于 所 有 接 近 金 属 开 放 结 合 位 置 ，这 也 许 在 酶 的 作 用 机 制 及 特 异 性 方 面 起 着 重 要 作 用 。另 外 ，在 所 有 的 F e一S O D 中均 存 在 严 格 保 守 的 Gl n 7 O 和 T ”34 之 间 的 相 互 作 用 。超 氧 化 物 岐 化 酶 (s O D ) 由 sodB 基 因编 码 ，是 生 物 体 防 御 氧 化 损 伤 的 重 要 金 属 酶 系 之 一 。S O D能 清 除 生 物 体 在 有 氧 代 谢 过 程 中产 生 的代 谢 产 物 超 氧 自由 基 (q 一) 而 保 护 细 胞 免 受 活 性 氧 簇 恤 班比ve oxygen sPeeies，Ro s) 的破 坏 。se 贝er 等 1261 最 先 构 建 无 s 0 D 酶 活 性 的 sod 基 因缺 陷 突 变 株 ，研 究 发 现 突 变 株 的 生 长 和 存 活 状 态 下 对 仇 和 H Z仇 非 常 敏 感 ，与 野 生 株 相 比 ，突 变 株 抗 氧 化 应 激 能 力 下 降 ， 并 且 发 现 突 变 株 在 小 鼠 胃 内定 植 率 明显 低 于 野 生 株 。 因 此 认 为 S O D 是 可 以影 响 H. p 尹。ri 在 胃 内定 植 的 重 要 毒 力 因 子 ，它 的存 在 对 于 H. p 贝。ri 在 氧 化 应 激 状 态 下的 生 长 和 存 活 非 常 重 要 。幻 m等 127 利 用 基 因 芯 片 研 究 了 由于 对 细 胞 的 粘 附 而 引起 H. p 贝。ri 基 因 的表 达 情 况 ， 结 果 发 现 了应 激 反 应 基 因 sed B 的 下 调 ，进 一 步 证 实 :odB 参 与 细 胞 粘 附 过 程 ，并 可 能 与 H. p ylori 定 植 有 关 的 结 论 。新 近 w an g 等 128】 报 道 ，作 为 H. p 贝ori 抗 氧 化 系 统 的 重 要 成 员 s 0 D 与 从 p (烷 基 过 氧 化 物 还 原 酶 ) 对 H. p 贝。ri 在 宿 主 胃 内 的 定 植 至 关 重 要 。幽 门 螺 杆 菌 中 S O D 蛋 白为 F e-S O D ，晶 体 结 构 最 显 著 的 特 点 是 它 的 活 性 部 位 结 构 保 守 。 尤 其 在 二 聚 体 表 面 相 互 作 用 部 位 非 常 保 守 。 与 其 它 有 生 物 活 性 的F e-S O D 结 构 相 比 ，幽 门螺 杆 菌 F e-S O D 有 一 20 个 C 一末 端 尾 巴 ，呈 Q 一螺 旋 结 构 。 我 们 可 以推 测 ，这 个 结 构 与 S O D 吸 附 在 细 菌 表 面 有 关 ，并 且 也 可 能 是 S O D 磷 酸 化 的 部 位 。至 于 H P S O D 蛋 白翻 译 后 修 饰 的 意 义 ，以及 与 其 定 位 的 关 系 还 需 进 一 步 研 究 。r29，o多一本 实 验 基 于 以上 研 究 ， 首 先 根 据 gen eb ank 给 出 的 sed 基 因 序 列 设 计 引 物 ， 提 取 H P2 7D N A 进 行 P C R ，扩 增 出 sed 基 因 ，连 接 到 P M D 19一 载 体 上 ，然 后 酶 双 切 连 接 到 表 达 载 体 p E T 30 (a)上 ，转 化 后 优 化 表 达 并 纯 化 出 s o D 蛋 白 ，将 其 作 为 抗 原 免 疫 动 物 制 备 出 多 克 隆 抗 体 ， 为 下 一 步 验 证 cagA 基 因 敲 除 H P2 7 突 变 株 与 野 生 株 的 菌 体 表 达 差 异 蛋 白之 中 确 实 有 S O D 蛋 白做 好 储 备 。 也 为 进 一 步 研 究郑 州 大 学 20 ()9 届 硕 士 研 究 生 论 文幽 门螺杆 菌 s od 基 因克 隆- 表 达 及 多克隆抗 体制 备cagA 基 因 在 H. p ylori 中 的致 病 机 制 以及 sod 基 因 在 H. p 贝。ri的重 要 作 用 打 下 基 础 。本 研 究 主 要 技 术 路 线 图H HHP刀 菌棣 剧 和和H HHP 刀 总 D N 入扭取取弓弓防设计 ，引入西恻 汰 N 山I、x 加 III枕枕R 扩增 和d 羞因片段段段月随D 19- T 载体体表体现饭体 护盯 刃 ( 。) )重组质拉 n 协D 1 9刁记记盆盆组质 粗 p 盯 1 陌闭 转化 D H j aa a转转化 B U II IIPIIT G 诱导 体现达N NN卜N T A 柱层析 纯 化化免免搜动物 制备多交挂 血洛抗体体日J s A 法检 测血 涪抗 体效 价郑 州 大 学 2以珍届硕 士研 究 生 论文 幽 门拐杆公 翻睡裁 圈 多充班杭律侧各2 材 料 与 方 法2.1 实 脸 材 料2.L I 实脸动 物 、质 粒 与菌株幽 门娜 杆 菌 助 27 (H eli cob ac扭盯洲 顾27 ) 由本 实 验 室 保 存 。大 肠 杆 菌(D “饭幼血 。以正p H 5a 、B L2 1 均 由郑 州 创 生 生 物 工 程 有 限 公 司 提 供 . p M D 1 9 .T 载 体购 自 毛止盯. 公 司 ，见 图 I 。体现 载 体质粒 pE T-30a ，为本 实验 室保存 ，该质 粒 为含 有 现 s 标 签 的 原 核 融 合 表 达 质 粒 ，结 构 如 图 n 。图 1 p M D 18 、 19-T 载 体 的结 构 示 愈 图郑 州 大 学 2 加 9 届 硕 士 研 究 生 论 文幽 门螺杆 菌 so d 基 因 克 隆 表 达 及 多克 隆抗 体 制 备l月. 甲 璐. 抽叻 .脚 .缈 ，牙. 翔砚 甲 口 ，爹咧 位罗 月瑟路n . 11够 怕句r 、.喊二扭们目. 帅 闷翔. 娜 帅声秘 ;/ 习砂 犯. 娜甲 . 脚 协p ”月吮娜 .每 如口娜 ，翻 . 盆价翻 每 、翻加 .口1询嘱旗1争田 I fll帅刊卜月弓( ，: 娜日目E l气I习娜p气架黔(+)内 田 .口翻切享日“心了!p . 翻日比H l气，. 协浏肠N 物 娜卜H 口 娜 . 每臼娜 S为 h 人物 创出 阵 U时 I口二门几 p l价翻母臼 盆，价 任别场稗入 消 I扮户困口n 加，” 脚 翔，一卜，。”一牛卫黑卫 旦竺， 华争拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿拿 e舀岛6娜亡r心叫拍!t禹C支。G亡犷了鱿G舀JCC纽口C比几C丁eG盈日仁八CC盆CC几C鱿亡亡t为.止亡触触触匕改 改犷C 助 I C C 仁G C 分氏幼 I T 脚六I 两C 助 亡 万C 气亡I 几萝八口份G 点盛T 下右T 公八G C 公月 匀人人C 声几T l 亡C 亡! 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