人的外周血淋巴细胞培养

人的外周血淋巴细胞培养摘 要： 正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。1关键词： 外周血淋巴细胞 低渗处理 空气干燥法 染色体组型分析前 言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞2，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使 细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染 色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈 现明显形而利于辨认。淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素低渗处理充分的固定滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。3淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。2染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较 好的固定效果。1.材料方法1.1 材料人的外周血淋巴细胞。1.2 器具采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪1.3 药品1.3.1 RPMI“1640”培养基称取“1640”粉末 1.05 g，用 100 mL的双蒸水溶解，溶解后 pH 值调至 6.0。每1000毫升溶液加NaHCO31.0克，校正PH到7.1。1.3. 2 肝素作为抗凝剂使用。称取该粉末8 mg（每mg含 126 单位）， 用 2 mL的生理盐水溶解，此溶液的浓度为 504 单位/mL。1.3.3 生理盐水用0.9克NaCL加入100mL蒸馏水中，配制溶液。1.3.4 秋水仙素作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素1mg，用25mL生理盐水溶解，然后放入冰箱4保存。使用时用1mL注射器吸取该溶液0.1mL加入5mL的培养物中，其最终浓度为0.8微克/毫升。1.3.5 植物凝血素（PHA）是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，本实验采用的是市面上购买的PHA粉末，一个针剂为0.2mL。将1瓶粉末溶在2mL的蒸馏水中。1.3.6 抗菌素 青霉素（以每瓶 80 万单位为例）：将1瓶青霉素溶在8mL生理盐水中，则每毫升含10万单位。取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为1000单位/mL。 链霉素（以每瓶 100 万单位为例）：以4毫升生理盐水稀释，则每毫升含100万单位，取0.1mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为100单位/mL。1.3.7 吉姆萨染液实验室中有现成染液1.3.8 3.5%NaHCO3溶液实验室有已配好的试剂。1.3.9 0.1mol/L磷酸缓冲液实验室有已配好的试剂。2 方法步骤2.1 分装培养液用移液管将培养液和其他各试剂分装入培养瓶中，每瓶量为：RPMI“1640”培养基 4mL小牛血清 1mLPHA 0.2mL双抗（青霉素加链霉素） 0.1mL 用3.5%NaHCO3溶液调pH到7.3，分装到20mL的培养瓶中，盖好盖子，用标签纸标清姓名，置于冰柜中保存。用前从冰柜内取出，放入37恒温锅中温育10min。2.2 采血用酒精消毒手指皮肤，用采血针刺破皮肤，再用毛细管取血0.3mL全血，吹入瓶中,轻轻摇动几下，盖好盖子，直立置于37恒温箱内培养。 2.3 培养置 37温箱内培养72 小时这个时间恰好是白细胞分裂的两个周期。2.4秋水仙素处理培养终止前在培养物中加入浓度为40g/mL的秋水仙素0.1mL，最终浓度为0.8g/mL，置恒温箱中处理4h。2.5 低渗处理 秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液(蒸馏水)5 mL，用 滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中置 37温箱处理 20 min，使红细胞 破碎，白细胞膨胀。 2.6 离心以1000r/min，离心 5min10s，弃去上清液，收集白细胞。2.7 固定 加入固定液（甲醇冰乙酸=3l，临时配制)3 mL， 片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液， 在室温中固定 15 min后， 离心， 吸去上清液，留下白细胞。 2.8 再固定加入固定液 2 mL，用吸管轻轻打散，室温下继续固定 15min （过夜也可以） 。 2.9 再离心以1000r/min，离心 5min10s，除去上清液，留下白细胞制片。2.10 制片用吸管吸取细胞悬液自1m高处，滴在从冰柜中取出的一块干燥洁净的载玻片上,每片滴加悬液 13 滴，用嘴轻轻吹散，在酒精灯火焰上微微烤干。2.11 染色用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释过的Geimsa 染色液(110)染色 20min，然后倒去多余染液。并用蒸馏水轻轻冲洗。2.12 镜检 待稍干后，在显微镜下观察。先用低倍寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。 选择染色体清晰、分散度好的细胞进行核型分析。 3 结果分析3.1实验结果该图为显微镜视野内所拍到的图 3.2 核型分析：人类每个体细胞有 46 条染色体，22 对常染色体和一对性染色体，男子是 46，XY；女子是 46，XX。可以将人的 46 条染色体分成 A、B、C、D、 E、F、G 七群，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。三个参数：（1）染色体的相对长度 （2）臂比率 （3）着丝点指数 4 分析讨论 4.1实验误差分析实验利用的是植物凝血素(PHA)使停止分裂的细胞恢复分裂的原理来获得大量的有丝分裂细胞，从而便于对染色体经行观察。但淋巴细胞经过培养后，制成的标本质量不佳，染色体不明显,视野中除有染色体以外还有杂菌等,其原因可能为：(1)未作灭菌处理，由于细胞培养是在37的环境中进行的，而此温度也是细菌繁殖的最适温度，所以杂菌会出现在视野中。(2)秋水仙素处理不当，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。(3)低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。(4)低渗处理完后，细胞悬液可能并没有变浑浊，这有可能是用蒸馏水做低渗液没有使红细胞完全破裂，没有使白细胞充分的膨胀，从而会影响到观察的结果。(5)在两次离心后，在离心管底没有看到明显的沉淀，有可能是培养基酸碱度没有调到最适的pH值或是培养时间短而导致白细胞量不足，从而影响了观察结果。(6) 标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。(7)载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且细胞随液体流动而丢失。(8)载玻片冷冻不够：合适的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。(9)核型图中染色体有的变粗，而有的很细小。造成这种结果的原因可能是秋 水仙素处理不彻底，一部分染色体加倍，而一部分没有。4.2 实验注意事项 4.2.1接种的血样愈新鲜愈好,最好是在采血后 24 小时内进行培养,如果不能立刻培养,应置于4存放,避免保存时间过久,会影响细胞的活力.4.2.2在培养中成败的关键,除了至为重要的 PHA 的效价外,培养的温度和培养 液的酸碱度也十分重要.人的外周血淋巴细胞培养最适温度为 370.5.培养 液的最适 pH7.27.4.4.2.3 适量的秋水仙素、适宜的处理时间，是获得良好分裂相的先决条件。这将影响分裂相的多少和染色体的长短。由于秋水仙素有强烈的毒性作用，用量过大，作用时间过长，可使缩短和发生异常分裂现象，甚至导致染色体破碎；反之，则染色体数量少而形态细长。 都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。4.2.4 低渗处理是获得分散良好的分裂相的关键步骤。低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度 及时间要适当。低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。注意，低渗液在使用前需要在37温箱预温。4.2.5 充分的固定是制备良好分散的染色体的重要步骤。如果染色体分散的不好，可在余下的细胞悬液中改为甲醇：冰醋酸=1:3的固定液，有时可改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷。固定时间可以延长数小时或过夜。特别要注意的是，固定液要新鲜配制，否则将会形成酯类，从而影响固定的效果。4.2.6 固定液纯度要高，临用时新鲜配制，应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定 液加入太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固定液作用不足，染色体出现 毛刷状。4.2.7 滴片是制备染色体的最后一步，也是非常关键的一步。首先载玻片要非常干净，否则将会影响染色体的分散的效果。其次，滴片的距离、滴加量的多少、制片的方式都会影响到染色体分散的效果。分裂相过多或过少，染色体过于分散都会影响到染色效果和观察。4.2.8 在整个操作过程中，要注意不要将细胞吸到吸管上部，也不要接触离心管的上部，否则将会丢失许多细胞。4.2.9 机械打散细胞团时，用力要适度，若用力过猛，细胞易破碎，染色体不完整。 4.2.10 制片过程中,如发现细胞膨胀得不大,细胞膜没有破裂,染色体聚集一团伸展不开,可将固定时间延长数小时或过夜.4.2.11 配药品时需要注意分析天平是否水平。 5 内容改进5.1 抗菌素的配制以青霉素为例：青霉素，每瓶80万单位，可用1.6mL生理盐水稀释，则每毫升含50万单位。取0.01mL加入5mL培养基中，则最终浓度为1000单位/毫升。这样，相对1.3.6中的液体取用量减少很多，相对的节约了药品。5.2 离心机的使用由于所使用的离心机在离心前，需要一定的时间加速到所需转数，因而设置时间时要比预定时间久一点。据观察，该仪器加速时间为20s，所以在该实验中应将设定时间为5min20s。参考文献：1刘祖洞，江绍慧主编.遗传学实验.高等教育出版社.北京2李亚轩，赵昕主编.遗传学综合实验.科学出版社.北京3吴鹤龄，林锦湖主编.遗传学实验方法和技术.高等教育出版社.北京