正畸治疗前后患者口内菌群变化检测和分析

研究背景:有报道显示我国儿童与青少年的错牙合畸形患病率为 1 。颌面部畸形直接影响到 儿童颌面部生长发育、口腔健康、功能和容貌外观以及心理健康。正畸矫治的病患随 着生活水平的增加也逐年增多。正畸固定矫治中，很多患者在矫治过程中会出现牙齿 表面釉质脱矿的现象。有研究显示，牙齿表面釉质在固定正畸矫治过程的脱矿率大约 为2-97%2, 3。这些现象可能与正畸矫治器的粘接有关，因为在固定矫治过程中牙 齿上需要粘接托槽、带环等矫治附件，这些附件可能会使牙齿表面清洁受限、软垢滞 留，从而影响口腔健康。但是在临床治疗过程中我们也经常发现，有些正畸固定矫治 的患者虽然在矫治过程中软垢很多、口腔卫生很差，而且矫治时间较长，牙面也未出 现明显的脱矿现象11。那么在固定正畸矫治过程中的釉质脱矿的原因是什么呢？本 研究从微生物学方面对正畸患者佩戴矫治器前后进行菌群测定，分析正畸患者在固定 正畸矫治前后口腔菌群的变化及其与口腔健康的关系。研究目的：探讨正畸固定矫治前后患者口内菌群的变化；将患者口腔菌群的变化与患 者口腔健康相联系研究两者之间的相关性。研究方法:从2013年8月-2014患者中随机选取口内牙齿没有明显脱矿患者20名，于正畸矫治 前刮取其上颌前牙牙区菌斑，分为未治疗组组；选取正畸治疗超过六个月并且前牙未 出现明显脱矿且口腔健康状况良好患者20名，取同样区域菌斑为正畸治疗组。年8月 间在山东大学口腔医院正畸科正在进行固定正畸矫治。取牙面菌斑样本，菌斑基因组DNA提取后PCR扩增，最后对扩增子进行测序和分析, 检测正畸前后口内菌群的变化情况。结果:研究结果显示来自正畸治疗组的菌斑多样性与未治疗组没有明显差异（P）。实验测 得口腔内约有238个不同的细菌菌属与维持口腔微生态平衡有关。其中10个属的细菌 含量较高，占整个口腔的 70%,分别是 Parascardovia , Rothia, Corynebacterium,Leptotrichia, Streptococcus, Selenomonas, Prevotella, Capnocytophaga, Hylemonella。通过将正畸前后牙面菌斑比较，我们发现有6个属的细菌存在差异。6 个属的细菌包括在 Parascardovia, Leptotrichia, Corynebacterium , Streptococcus , Selenomonas,以及Prevotella。我们的实验结果表明，正畸治疗前后菌群结构存在一 定的差异性，多种菌属与龋病的发生可能存在正相关或负相关关系，而这种菌属的改 变在临床并未引起相应口腔健康的改变，我们可以认为在正畸治疗以后口腔内微生物 菌群建立了一个新的稳定生物体系。结论:患者戴用固定矫治器后，出现了局部牙面菌斑中Streptococcus, Corynebacterium, Leptotrichia, Antinomycetes,以及Lactobacillus总菌群中含量明显增高的情况。本研 究结果提示，患者戴用正畸固定矫治器后，局部牙面菌斑中的菌群构成发生改变，并 且进入一种新的稳定平衡状态。关键词：固定正畸治疗16S rDNA菌属含量前言临床上正畸患者的口腔卫生的保持一直是比较难以维持的。在临床上我们就经常发现 许多固定正畸矫治的患者在矫治过程就发生了牙面脱矿的现象。显然这与牙面菌斑在 固定正畸矫治的附件周围聚集有一定的关系4, 5。可能是因为在正畸治疗过程中会出 现口内菌群的紊乱，牙周治病菌以及致龋菌比例增多的现象，从而导致牙周炎以及釉 质脱矿的发生。有研究显示，固定矫治过程中发生釉质脱矿的概率大约为2-97% 2, 3,其主要表现为脱矿牙釉质表面光泽度下降呈白垩色，影响美观，严重者可导致龋 的发生4。也有调查显示固定矫治器粘接6个月内脱矿的发生率明显增加，6-12个月 间脱矿发生率也会有所上升1。另一方面在临床治疗过程中也经常发现，有些接受正畸固定矫治的患者即使在矫治过 程中软垢很多、口腔卫生很差，同时矫治时间较长，牙面也未出现明显的脱矿现象以 及牙周疾病，在这种情况下口腔内菌群又发生了什么样的变化？本实验使用16S rDNA测序的方法，分析口腔菌群在正畸前后发生的变化。16S rRNA 位于原核细胞核糖体小亚基上，包括10个保守区域和9个高变区域，保守区在细菌种 属之间没有很大的差距，而高变区域在细菌种属之间有明显的差异。因此，16S rDNA可以做作为分别生物物种的特征核酸序列，已经被广发认为是可以较快且准确分析细 菌系统和分类鉴定的指标。以往454测序平台以读长优势广泛应用于16S rDNA测序 领域，但是随着MiSeq平台双端PE250和PE300测序策略的发展，读长不断增长，使 得基于MiSeq测序研究物种多样性的准确性大幅度提高7，所以已经成为研究微生物 群落多样性的首选之策8,9。根据所扩增的16S区域特点，基于Illumina MiSeq测序 平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法，构建小片段文库进行双末端测序。通 过对Reads拼接过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，并进行物种注释及 丰度分析，可以揭示样品物种构成；进一步的a多样性分析(Alpha Diversity)邙多样性 分析(Beta Diversity)可以分析样品之间的差异。本研究从微生物学方面应用16S rDNA测序的方法对正畸患者佩戴矫治器前后进行菌群 测定，分析在正畸固定矫治前后患者口内菌群的差异及其影响。材料与方法1. 实验材料实验试剂(1) PBS缓冲液(上海研域试剂有限公司)(2 ) Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix ( New England Biolabs 公司)(3 ) GC 缓冲液(New England Biolabs 公司)(4 ) DNA纯化回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)（5 ）蓝白斑筛选试剂（上海生工生物工程有限公司）（6 ）胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉（上海生工生物工程有限公司）（7）Eppendorf管（海门市盛邦实验器材有限公司）主要仪器设备（1）DLCJIN型高性能超净工作台（哈尔滨市东联电子技术公司）（2）MLS3750型高压灭菌器（日本SANYO公司）（3）MDF 一 382E型超低温冰箱（日本SANYO公司）（4）TGL_16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）（5）ND 一 2000C型微量紫外分光光度计（美国NanoDrop公司）（6）PowerPac 3000 型 Biorad 电泳仪（美国 BIO . RAD 公司）（7）1 704406型小型水平电泳槽（美国BIO . RAD公司）（8 ） GelDoc 2000型凝胶成像系统（美国BIO . RAD公司）（9 ） LightCycler 480 RealTime PCR 仪（瑞士 Roche 公司）（10 ）微量移液器（德国Eppendoff公司）（11）生物安全柜（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）（12）梯度PCR仪（德国Biometra公司）2. 实验方法研究对象研究对象的选择从2013年8月-2014患者中随机选取口内牙齿没有明显脱矿患者20名，于正畸矫治 前刮取其上颌前牙牙区菌斑，分为未治疗组组；选取正畸治疗超过六个月并且前牙未 出现明显脱矿且口腔健康状况良好患者20名，取同样区域菌斑为正畸治疗组。每位受试者的共同纳入标准：（1）近期居住在山东地区的汉族人群，有相似的饮食习惯；（2）口腔卫生可，没有明显牙周炎，龋病以及釉质脱矿等口腔疾病；（3）近1个月内未使用抗生素、益生菌或益生元等微生态制剂；（4）无其他严重全身疾病及并发症，女性非妊娠期或哺乳期；(5 )近1年内未接受过牙周治疗;(6 )无吸烟史；(7)年龄在14至28岁。对研究对象的年龄分布均衡性检验对患者年龄分布均衡性检验经X 2检验结果显示，实验组以及对照组年龄分布具有均衡 性(见表1)表1患者年龄均衡性检验(X+SD,单位：岁)指标分组P值未治疗组正畸组年龄(岁)+ 21+说明：？值，组间数据结构无显著差异临床参数和标本收集问卷调查问卷主要包括（姓名、性别、年龄、民族、联系电话、家庭住址、身高、体重、生活 等）、全身系统性疾病史、口腔相关信息（是否有刷牙或咬硬物出血、是否有牙齿松动 或咀嚼无力、牙周治疗史、牙周炎家族史）。临床检查检查患者口内有无龋坏，有无缺失牙齿。使用Williams牙周探针，检查并记录每位受 试者现存牙（第三磨牙除外）的牙周临床指标，包括探诊深度（PD）、附着丧失（AL）、探诊 出血（BOP）。所有检查均由同一名医师完成。实验样本收集选取口腔卫生较好的患者作为实验群体，样本采集时间在饭后2-4 h，采样前先用清水 鼓漱约1min，以除去食物残渣，隔湿、干燥后用无菌探针于患者下颌前磨牙唇颊侧托 槽龈方牙面刮取适量菌斑。置于2ml无菌eppendorf管（取样前称重并记录其重量， 盛有PBS转运液），半小时内送至实验室，再次称重取差值得样本质量。菌斑DNA的分离将存储菌斑标本的缓冲液解冻后，抽提菌斑细菌基因组DNA，具体操作过程如下：（1）解冻后的存有样本菌斑的缓冲液离心，15,000rmp离心十分钟，去除上层清液。（2）在沉淀中加入裂解液ATL，上下颠倒使之混匀。（3 ）在每管中加入20pL蛋白酶K溶液以及错珠，颠倒使之混匀，在振荡器上振荡3次，每次1min。(4 )振荡完成后，在561的水浴箱中静置45min。(5 )于每管中加入200裂解液AL,混合均匀后置于70OC的水浴箱中40min。(6)加入200无水乙醇，混合均匀后加入分离柱中，简短离心。(7 )丢弃过滤液，把分离柱放入新的收集管中，用AW1 , AW2清洗两次。(8 )最后用10洗脱液洗脱DNA两次，提取后的DNA-20C保存。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度1. 制备1%的琼脂糖凝胶，称取的琼脂糖加入40mlTBE缓冲液中，微波炉中加热至琼 脂糖完全融化，在室温条件下冷却到65C左右。2. 在琼脂糖中加入锈乙锭贮存液，将其缓慢倒入事先准备好的制胶器中，防止出现 气泡，凝胶的厚度控制在，室温下放置至凝胶完全凝固，小心取出梳子，将制备好的 凝胶放入电泳槽内。3. 在电泳槽内加入TBE缓冲液至液面刚刚淹没凝胶表面。4. 将制备好的产物与10x上样缓冲液混匀，将其加入到上样孔中，同时在一边加入伐 的DNA分子maker。5. 通电进行电泳，电压100V开始电泳，根据指示剂迁移的位置决定是否停止电泳，观 察电泳结果(如图1)。PCR扩增取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/plo稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；使 用 New England Biolabs 公司的 Phusion? High-FidelityPCR Master Mix。引物对应区 域：16S V4区引物为515F-806R ； 18SV4区引物为528F-706R ； 18S V9区引物为 1380F-1510R ； ITS1 区引物为 ITS1F-ITS2 ； ITS2 区引物为：ITS2-3F-ITS2-4R。50pLPCR 扩增体系为：DNA 模板量：pL , dNTP( 200pmol/L):4pL , 10xBuffer:5pL, Taq 酶(5 U/pL) :pL , Primer(10pmol/L):2pL ,补足 ddH2O 至 50pL。PCR反应程序为：94 C 3min变性(DNA双链解离)94 C 1min 变性65 56 C 1 min退火30个循环72C 1min 延伸72C 7min4C 10minPCR产物的混样和纯化根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物,结果如（图2），因浓度较低进行第二次PCR，以及PCR产物检测（图3,4）. 使用Thermo Scientific公司的Gene JET胶回收试剂盒回收产物。文库构建和上机测序使用 New England Biolabs 公司的 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使 用MiSeq进行上机测序。信息分析将测得的原始数据进行过滤分析，去除干扰数据（包括接头信息，低质量碱基，未检 测出的碱基等），得到有效数据。然后基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类分 析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结 果。再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进 行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上，可以进行一系列的基OTUs、物种 组成的聚类分析，PCoA和PCA、CCA和RAD等统计比较分析，挖掘样品之间的物种 组成差异，并结合环境因素进行关联分析。结果测序后所得结果经过16SrDNA测序后，一共得到751,858条基因序列，经过对原始数据的拼接，过 滤，得到约710，825条高质量的有效数据，测量结果如表（2）。其中正畸前有效数 据为360，632条，正畸后的有效数据为350,193条。平均序列长度为253bp。表（2）数据产生的统计信息表2.正畸矫治前后口内牙面菌群的丰度和分类物种信息的读取数据以及初步分析为了研究样品的物种的组成多样性信息，对所有样品的全部EffectiveTags序列聚类，以97%和95%的一致性（Identity ）将序列聚类成为OTUs （Operational Taxonomic Units）结果。在OTUs构建过程中，对不同样品的Effective Tags数据，低 频数的Tags数据和Tags注释数据等信息进行初步统计，统计结果的展示（见图 5）。将两组以97%的一致性聚类成为的OTUs数目进行方差分析，发现非矫治组与正 畸矫治组的OTUs数目没有明显差异（P）。选取最大相对丰度排名前10个属所对应的OTUs的系统发生关系数据，并结合每个 OTUs的相对丰度及其代表序列的物种注释置信度信息，整合结果展示（如图6 ）所 示，可以直观的展示研究环境中的物种组成的多样性。正畸前后患者口内菌群的丰度和分类样品复杂度分析（Alpha Diversity）Rarefaction Curve，即稀释曲线（见图7）,是从样品中随机抽取一定测序量的数据， 并且统计这些数据所代表物种数目（也即是OTUs数目儿以抽取的数据量和所测得的相 应物种数来构建的曲线。所以稀释曲线可以直接反映测序数据量的合理性，并间接反 映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数 据量只会产生少量新的OTUs。同时从Rarefaction curve也可以看出每组样品中在在 3%非相似度（如心上各个组可以得到约200种左右的种系。多样品比较分析（Beta Diversity）Beta多样性研究中，选用Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac两个指标来衡量两个样品间的相异系数，其值越小，表示这两个样品在物种多样性方面存在的差异 越小。以Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距离绘制的Heatmap展示结果(见 图8)。我们从图中可以看出与另一组在物种多样性上差别较大。分析主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，是一种应用方差分解，对多维数据 进行降维，从而提取出数据中最主要的元素和结构的方法26。PCA能够提取出最大 程度反映样品间差异的两个坐标轴，从而将多维数据的差异反映在二维坐标图上，进 而揭示复杂数据背景下的简单规律。如果样品的群落组成越相似，则它们在PCA图中 的距离越接近。展示结果见图9在门水平上进行分类将测序样品的序列进行比对，在生物分类学门的水平进行分析，主要有10个门的细菌 发现。它们分别是：Tenericutes，Synergistetes，Spirochaetes，Proteobacteria， Firmicutes，Cyanobacteria,，Bacteroidetes，Actinobacteria,TM7,Fusobacteria。其中 有五个门的细菌在其中占主要地位。它们分别是：Actinobacteria，Firmicutes， Proteobacteria，Bacteroidetes和Fusobacteria，并且其中有四个门的细菌在正畸组中 较非正畸组中有明显升高，它们分别是Firmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria, Fusobacteria。在属水平上进行分类在属水平进行分类，可以得到145个不同的属。其中10个属的细菌含量较高，占整个 口腔的 70%,分别是 Parascardovia , Antinomycetes, Corynebacterium, Leptotrichia, Streptococcus, Lactobacillus, Prevotella, Capnocytophaga, Hylemonella。通过将正畸 前后牙面菌斑比较，我们发现有5个属的细菌存在差异。5个属的细菌包括在 Streptococcus, Corynebacterium, Leptotrichia, Antinomycetes,以及 Lactobacillus 在正 畸组中有明显升高。在种水平进行分类两组之间存在着大量相同种的细菌将其中龋病主要致病菌Streptococcus, Antinomycetes,以及Lactobacillus前后数据提取出来统计分析，分析结果（如图10， 表3）表（3）非治疗组与正畸组比较变形链球菌放线菌乳杆菌分组P值P值P值非治疗组P正畸组P说明：未治疗组与正畸治疗组各组相比P值均小于讨论1.关于实验选择牙面的讨论我们在临床可经常发现在固定正畸治疗过程中上前牙区以及上颌磨牙区是最常会出现 釉质脱矿现象。并且有学者统计发现上前牙是在正畸固定矫治过程中最好发生牙釉质 脱矿的牙位10，般主要发生在牙面的唇颊面牙釉质，主要以托槽边缘处最为明显 12。同时也有国内外很多学者发现上颌牙齿的脱矿率高于下颌牙齿13，并且上颌侧 切牙的脱矿率最高。因此，由于上颌侧切牙的脱矿率最高，可能也相对说明上颌侧切 牙区牙面菌斑的成分改变较明显，故本实验选择上颌侧切牙作为实验的取样牙位。由 于本部分研究的目的是分析固定矫治器戴用后牙面的菌群变化情况，而我们在临床上 观察发现，戴用固定矫治器后虽然有比较高的釉质脱矿发生率，但大部分的患者还是 没有出现釉质脱矿的现象。故我们在研究中选用了在固定矫治过程中没有出现脱矿的 患者做为研究对象，这样可以比较好地反映固定矫治器戴用后牙面菌群变化的一般趋 势。同时本研究的样本量不是很大，如果将发生釉质脱矿的患者也包含在戴用固定矫 治器的患者中，与未行正畸治疗的个体进行比较，可能会因为发生脱矿的患者牙面菌 群变化比较大，而对研究结果造成一些偏差。2.正畸固定矫治与口腔健康的相关性在临床中经常可见在固定正畸治疗过程中引起许多口腔健康问题，比如釉质脱矿，牙 龈炎，牙槽骨吸收等等。造成这些口腔疾病的因素很多，但大部分研究认为口腔内菌 群的变化往往是直接作用因素。在正畸固定矫治过程中最常见的口腔疾病之一就是牙 面釉质脱矿。目前很多研究显示，多种致病菌与釉质脱矿相关，其中最主要包括变形 链球菌、乳杆菌、放线菌等7。本实验中对正畸矫治前后牙面菌斑的测定，来分析口 腔内菌群的变化，从而得出正畸固定矫治对口内菌群的影响。在一定程度上，固定矫 治过程中釉质脱矿问题的发生，可能与局部牙面菌斑中变形链球菌，放线菌以及乳杆 菌数量的增多有一定相关性。已经有学者的研究14中发现固定矫治器戴用三周后， 牙面菌斑中总菌数并没有显著增加，但是变形链球菌比例却有显著性的增高。在正畸 固定矫治中发生的牙面釉质脱矿，与龋病早期的釉质脱矿是相似的，如果这种脱矿问 题得不到控制，进一步发展都可能形成牙面龋损。很多研究也都已经显示出变形链球 菌是龋病发生的主要致病菌。虽然目前研究显示乳杆菌和放线菌不是龋病发生的主要 致病菌，但是这种细菌的增多会使菌部牙面的酸性环境增强，易于釉质脱矿情况发 生。由此可见，本研究显示的固定矫治器戴用后出现的牙面局部菌斑中变形链球菌， 放线菌及乳杆菌，与固定矫治器戴用后易出现釉质脱矿问题是有一定的机制相关性。 这种情况的产生可能与固定正畸矫治器附件粘结后，患者未能充分做好口腔的清洁， 使得牙面软垢附着增多14，继而使致龋菌易于大量聚集有关。有研究显示有釉质脱 矿的牙面其表面变形链球菌的数量多于邻近没有脱矿的牙面32。本研究虽然结果显 示固定矫治器戴用后牙面局部菌斑中放线菌及乳杆菌的数目及其在总菌群中所占比例 明显增高，但是牙面并没有出现脱矿的现象。也就是可能在固定矫治过程中，牙面局 部菌斑中菌群的改变能够进入一种矫治过程中的平衡状态。首先我们可以看到，固定 矫治过程中虽然比较容易出现釉质脱矿的现象，但不是每个患者都出现釉质脱矿的问 题。而且我们实验中所选的固定矫治患者就是在矫治过程中没有出现明显釉质脱矿的 患者，而我们的研究结果显示这些患者牙面菌斑中有变形链球菌，放线菌和乳杆菌增 多的情况，说明戴用固定矫治器后，虽然局部牙面菌斑中出现了致病菌增多的情况， 但这并不意味着患者就一定会有釉质脱矿情况出现，患者牙面菌群的变化的的一定范 围之内是有一定耐受的。也就是说固定矫治过程中虽然有致病菌增多的情况出现，但这种变化可以很快进入一种相对来说平衡的状态，并且有可能不随矫治时间的延长而 进一步恶化，也就是说患者如果能适应、耐受这种菌群环境，就有矫治时间增长，牙 面也不会出现釉质脱矿的情况。在本研究中，我们选择了固定矫治过程中没有发生釉 质脱矿的患者，与未经治疗的个体比较，发现患者戴用固定矫治器后，牙面局部菌群 会出现与釉质脱矿相关的变形链球菌、乳杆菌的数量及其在总菌中所占比例增高的情 况，而这些患者能够耐受这种环境，没有出现釉质脱矿的情况。但是在临床固定正畸 矫治的过程中，还是会出现相当一部分患者牙面发生釉质脱矿的情况，那么，这就有 可能是这些患者耐受不了这种菌群变化的环境而出现釉质脱矿，也有可能是这些患者 随着矫治时间增长，口腔卫生变更差等原因造成变形链球菌、乳杆菌数量、放线菌在 总菌中所占比例增高而导致的。结论本研究中，针对固定矫治过程中容易出现釉质脱矿的微生物机制问题，分析了固定矫 治器戴用后牙齿表面菌斑中变形链球菌、乳杆菌、放线菌的的差异性本研究主要结果 如下：患者戴用正畸固定矫治器后，口腔内菌群的种类少于未正畸矫治组，同时患者戴用固定 矫治器后，出现了局部牙面菌斑中 Streptococcus, Corynebacterium, Leptotrichia, Antinomycetes,以及Lactobacillus总菌群中含量明显增高的情况。本研究结果提示， 患者戴用正畸固定矫治器后，局部牙面菌斑中的菌群构成发生改变，并且进入一种新 的稳定平衡状态。在这种情况下会出现局部牙面菌斑中放线菌，变形链球菌及乳杆菌 总菌群中所占比例明显增高的情况，同时也有其他一些菌属的减少。这说明患者戴用 固定矫治器后局部牙面菌斑中的菌群会发生变化，并且进入一种新的稳定平衡状态， 这种菌群的变化可能是固定矫治过程中釉质脱矿发生的原因之一。而相对于固定正畸 未出现脱矿的患者，固定正畸患者治疗过程中牙面菌斑中所含变形链球菌，放线菌以 及乳杆菌的比例增高，可能是这些患者口腔内菌群处于一种的新的平衡状态有关。而 有的患者耐受不了这种菌群变化的环境而出现釉质脱矿，也有可能是这些患者随着矫 治时间增长，口腔卫生变更差等原因造成变形链球菌、乳杆菌数量、放线菌在总菌中 所占比例增高而导致的。这种机制提示，如果能早期发现患者的釉质脱矿指征，针对 致龋菌增多机制采取适当的抑制措施，有控制釉质脱矿进一步发展的可能性。