分离工程知识点总结

生物分离工程知识点总结（2014.12.11）：一、 概论：1. 生物分离工程的特点（1）目的产物来源和种类广泛，成分复杂（2）目的产物含量少,浓度低（3）生化产品的稳定性差，对操作条件要求严格 ：热、极端 pH 值和有机溶剂 等会引起变性失活 ；化学和微生物降解（4）产品的质量要求高2纯度、回收率和纯化倍数的定义纯度：1. ）生物技术产品的质量主要看产品的纯度和均一性,在纯化过程中需着重考虑 产品最终纯度要求。2. ）纯度受分析方法精确度的限制，3.）分离纯化过程中纯度可用于评价分离效果但不一定代表产品质量。 回收率单步操作回收率：操作后目标产物的总量与操作前目标产物总量比值，用 表示总回收率：经分离纯化得到的最终产物的总量与初始原料中产物的总量的比 值，用表示 ；总回收率等于各步操作的回收率的乘积 纯化倍数：纯化倍数：操作后纯度/操作前纯度单步纯化倍数 取决于所采用的纯化方法和纯化效果 总纯化倍数高低取决于目的蛋白含量比例和纯化效果【矛盾： 总纯化倍数越高，需要的分离纯化步骤越多，总回收率越低】3. 分离纯化的一般步骤不同产物、同一产物不同技术路线采用的纯化工艺不同，但分离纯化的主要工艺 步骤仍具有共同性：1. ）原材料的预处理：将目的产物从原始材料中提取出来2. ）固-液分离：固体杂质的去除3. ）目的产物分离：从提取物中去除可溶性杂质4. ）目的产物纯化：去除残留杂质使目标产物达到所需纯度5. ）对目标产物进行必要的后加工（修饰、加稳定剂、佐剂）4. 分离纯化的原则和目标 分离纯化的原则：（1）尽可能简单、低耗、高效、快速。（2）分离步骤尽可能少。（3）避免相同原理的分离技术多次重复出现（4）尽量减少新化合物进入待分离的溶液。引起新的化学污染；蛋白质的变性 失活（5）合理的分离步骤次序：先高通量，后低通量；先低选择性，后高选择性； 先低成本，后高成本。分离纯化的目标（1）最小化操作体积；（2）最少化操作步骤 （3）组合不同机理分离技术 分离纯化三部曲：“1. 提取；将目标产品从原料中初步纯化；浓缩和提高稳定性 （如：去除蛋白水解 酶）；去除主要杂质 。【重速度和处理量】2. 纯化：进一步去除杂质，纯化目标产品【重收率和处理量】3. 精制：去除痕量杂质；调整产品保存条件；保证试剂安全性 【重分辨率】5. 概念1）什么是生物分离工程？ 为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发 酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯 化、富集生物产品的过程 。分离强调将不同物质分离开；纯化强调产品纯度不断增加2. ）生物分离工程的单元操作单元操作：完成一道工序所需的一种方法和手段。目的产物与杂质之间在各物理化学和生物学性质上存在差异。利用各种差异选 用不同的分离方法可将目的产物分离出来。利用混合物不同组份间分配系数的差异，将其分配到两个或更多物相中，如盐 析、沉淀、层析、萃取等；在单一物相中利用不同物理力场将混合物中各组份分配到不同区域中去，如超 速离心、超滤等可利用来进行分离的性质有：分子大小、分子量、分子形状、溶解度、电荷性、 疏水性以及与配基亲和力等二、细胞破碎、提取和粗分离（1）细胞破碎法的分类、特点和应用1.为什么要进行细胞破碎？对于胞内产物，需要进行细胞破碎，使代谢产物进入液相，再进行细胞碎片的分 离。2.什么是细胞破碎？细胞破碎技术是利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物（包括目的产物） 释放出来的技术。细胞破碎的难易程度取决于细胞壁聚合物网状结构的交联程度、聚合物种类、细 胞壁厚度、细胞生长条件等方面： 动物细胞：无细胞壁，低渗透压或低水平剪切力下易碎 植物细胞：破碎难易差别较大微生物细胞：多数较难破碎3. 细胞破碎的分类和应用有哪些？d破碎细胞的方法和技术压榨71渗透冻胀破壁破膜压撞剪切细胞破碎方法高压匀浆固体剪切非机械法液体剪切溶胞作用去垢剂冻溶法机械法化学超声酶溶珠磨高压匀浆法同高速珠磨法的比较指标高压匀浆法高速珠磨法操作参数少，易于确定多，凭经验估计操作次数2-4次4次冷却换热器级间冷却夹套冷却，减少产品 失活可能应用范围丝状真菌和小革兰氏阳性 菌,及含包涵体细胞除外几乎所有微生物制备放大易较难不论高压匀浆法和高速珠磨法，都不仅以破碎率为基准, 而需考虑产物的收率和兼顾上下游过程技术原理效果成本举例高压匀浆法须使细胞通过的小孔， 使细胞受到剪切力而 破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处 理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠 捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理超声破碎法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中曰丰 匚pg细胞悬浮液小规模处 理（2）离心的原理、特点和应用1. 离心的原理：利用转鼓高速转动所产生的离心力来实现悬浮液、乳浊液的分离 或浓缩。2. 离心技术的特点【优点】:分离速率快、分离效率高、液相澄清度好应用非常广泛，可对那些颗粒很小或液体粘度很大、过滤速度很慢甚至难以过 滤的悬浮液进行分离密闭，生物安全性好可低温，有利于活性保持【缺点】：设备投资高、能耗大连续排料时，固相干度不如过滤设备3应用：离心机（管式，碟式，三足，超高速离心机）（3）盐析沉淀法和低温乙醇沉淀法的基本原理和应用【盐析沉淀】1基本原理：蛋白质分子表面的疏水性区域都聚集着许多水分子，当盐类被加 入时，这些水分子被抽出，以便与盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域相 互结合，形成沉淀。2.影响盐析沉淀的因素1）盐离子种类及浓度口 . er理论，半径小而带电荷高的离子盐析效果强，反之亦然。P0些刺胪Ac-F-Cl- Br-SCN-44Al3+NH4+K+Na+Mg2+Ca2+Ba2+低盐盐溶，高盐盐析2）生物分子浓度：共沉淀现象，需稀释3）pH：生物分子表面电荷多不容易沉淀，pI4）温度：一般升高温度溶质溶解度增加3应用：（硫铵沉淀）【低温乙醇沉淀法】1基本原理：有机溶剂破坏溶质分子水化层使之脱水聚集；有机溶剂介电常数比水小，加入后 降低溶液介电常数，带电溶质分子相互聚集而沉淀 。2.应用：人血浆低温乙醇沉淀法： 乙醇的加入能够显著降低溶液的介电常数，对蛋白质而言，环境介电常数越小 则其溶解度就越低。影响因素主要有pH、温度、蛋白浓度、离子强度和乙醇浓度，改变这些因素可以 从复杂的血浆混合物中提纯蛋白质。二、 膜分离技术原理（一）微滤、超滤、反渗透和透析的定义和原理膜分离技术定义原理微滤分离、截留直径为0.05 m 到10 m粒子筛分原理超滤分离分子量从1000到100万可溶性大分子大小筛分反渗透在高于溶液渗透压的压 力作用下，只有溶液中的 水透过膜，而所有溶液中 大分子、小分子有机物及 无机盐全被截留住渗透压差透析通过小分子经过半透膜 扩散到水（或缓冲液）的 原理，将小分子与生物大 分子分开的一种分离纯 化技术。浓差扩散（二）截留分子量定义截留分子量: 测定不同分子量的球形蛋白质或水溶性聚合物的截留率，可获得膜的截留率与溶质分子量之间的关系曲线，即截留曲线。一般将截留率为90%的溶质分子量定义为膜的截留分子量。（三）浓度极化和膜污染的形成、影响因素及减轻膜污染的方法1. 浓度极化A: 过滤，被膜阻挡物质在膜表面积累，形成浓度梯度B: 切向流动使膜表面积累的物质在剪切作用下返回液流当A速度=8速度时，在膜面附近形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层，这一现象称为浓度极化可逆过程，在过滤中产生，停止过滤，极化逐渐消失2膜污染（ 1）形成的原因Q凝胶层一浓差极化引起；Q吸附层一溶质在膜表面；Q膜孔堵塞；Q膜孔内溶质吸附（2）影响因素控制膜污染的相关因素- V膜材料膜的性质操作条件V膜孔径或截留分子量V膜结构 *组件结构 pH4温度V盐浓度4溶质浓度、料液流速与压力膜污染一膜材和孔结构最为关键Q膜材料：膜的亲疏水性、荷电性影响膜与溶质间相互作用亲水性膜和膜材料电荷与溶质电荷相同的膜较耐污染； 疏水膜进行预处理改进其耐污染性膜孔径或截留分子量待分离物质的大小与膜孔相近，易堵塞。对于不同分离对象，根据溶液中最小粒子及其特性不同，用实验选择 最佳孔径膜。膜结构原则：选择不对称结构膜较耐污染。Q组件结构：待分离溶液中悬浮物含量较高，产物在透过液中，膜组件易选择 ； 截留物是产物，并高倍浓缩，选用毛细管式与薄流道式组件。Q溶液pH :远离pl,增进蛋白质溶解度。溶液盐浓度无机盐对膜的影响：改变溶液离子强度；改变膜对蛋白质的吸附作用Q溶液温度：T高，粘度低，透过率高（存在蛋白质变性影响） Q溶质浓度、料液流速与压力：对于溶质浓度一定时，选择合适压 力与流速，避免膜过滤凝胶层形成（3）减轻膜污染的方法Q料液进行有效预处理：改善膜性质：Q选用亲水性膜或改变操作条件提高水温、降低膜两侧的压差或料液浓度（四）层析法（1）层析分离的基本过程1. 层析的分类Q吸附解吸类一一蛋白质分子与介质有相互作用离子交换层析、反 相层析、疏水相互作用层析、亲和层析非吸附解吸类一一蛋白质分子与介质之间没有相互作用 体积排阻 层析：根据分子大小进行分类（2）各种类型层析的原理和影响因素层析方法定义离子交换层析 一种基于表面电荷的吸附层析层析原理反相层析技术疏水层析亲和层析按生物分子疏水性进行分离的液相层析技术：基 于物质分子的疏水基团与层析介质上的疏水基 团相互作用在非极性固定相和极性流动相之间 不断分配：介质功能基疏水性的强即疏水侧链长 度和介质配基密度强的为反相层析技术。按生物分子疏水性进行分离的液相层析技术：基 于物质分子的疏水基团与层析介质上的疏水基 团相互作用在非极性固定相和极性流动相之间 不断分配：介质功能基疏水性的弱即疏水侧链长 度和介质配基密度弱的为疏水层析技术。相反电荷间相互作用的结果：蛋白 基团与离子交换基团相互作用，不 白电荷和相互作用不同；阴离子和 子交换，蛋白带负电，用阴离子交 反之，用阳离子交换；不同蛋白带 同，表面电荷分布不同，分离效: 多肽首先吸附于RPC介质的亲脂性 上，随有机相浓度的增加，基于样 固定相和流动相之间的分配系数的 异实现分离多肽首先吸附于RPC介质的亲脂性 上，随有机相浓度的增加，基于样 固定相和流动相之间的分配系数的 异实现分离是通过生物特异性差异分离样品的液相层析技生物特异性差异（3）层析工艺的优化1.离子交换层析的优化过程QPH的优化Q梯度方式的优化：阶跃梯度的优化Q流速优化：用高流速:高样品流通量 高产量；用低流速: 柱效最大化；2. 反相层析的优化过程：【提高分辨率和选择性的方法】Q1 流动相梯度：Q2 流速： 低流速。分离精度高3. 疏水层析的优化过程Q1 筛选固定相Q2 优化流动相的盐类型和盐浓度Q优化洗脱梯度和流速、温度、添加剂、pH4. 亲和层析的优化过程吸附条件缓冲液组成、流速Q2 淋洗条件淋洗缓冲液强度应介于吸附和洗脱之间Q3 洗脱条件破坏静电作用、疏水作用和氢键，蛋白质耐受性，改变pH