小球藻的培养

一、小球藻小球藻是单细胞植物，种类较多，多数生活在淡水中，少数生活在海洋里。按植物学分类，小球藻属于小球藻纲绿藻目原球藻科生物，其体型小，直径一般为35m，在显微镜下，需要放大400600倍才干看到，我们肉眼看到的只但是是具有小球藻的绿色的水。小球藻所含的营养成分很高，其蛋白质含量达到50%60%（相称于花生米的2倍、鸡蛋的5倍），含脂肪10%30%，还具有多种维生素。小球藻的生物活性物质糖蛋白和多糖体的含量也相称高，这些生物活性物质具有增强人体免疫力、抗癌、降血压、克制血糖上升、排除体内毒素和迅速恢复机体损伤等功能。因此，小球藻的培养前景广阔。 作为培养原料的小球藻，可以到较清洁的池塘、水坑中采集绿色的水，在显微镜下鉴定，然后再用。也可以向培养它的人索取。 1 容器的准备小规模的培养可用瓶、缸等，大规模的培养可用水泥池。一方面，要对所使用的容器进行消毒，一般用100mg/L的漂白粉水溶液浸泡，再用水冲刷多次。(100mg/L的漂白粉水溶液的配制：天平称量5g2%漂白粉澄清液；定量转移至容量瓶中；加水至1L；混匀。2漂白粉上清液的配制法：取漂白粉2克，加少量水搅匀，再加水至100毫升，充足调匀后，待澄清后取上清液使用。） 2 培养液的准备（1）BG11液体培养基配方： Stock1 定容100mL 柠檬酸 0.3g 柠檬酸铁胺 0.3g EDTANa2 0.05g Stock2 定容1000mL NaNO3 30g K2HPO4 0.78g MgSO47H2O 1.5g Stock3 定容100mL CaCl22H2O 1.9g Stock4 定容100mL Na2CO3 2g Stock5 定容1000mL H3BO3 2.86g MnCl24H2O 1.81g ZnSO47H2O 0.222g Na2MnO42H2O 0.391g CuSO45H2O 0.079g Co(NO3)26H2O 0.049g Stock1 取用2mL Stock2 取用20mL Stock3 取用2mL Stock4 取用1mL Stock5 取用1mL 总定容 1000mL（2）购买元/套，九种原液各200ml（稀释1000倍），10瓶。培养基各取1ml。联系电话： 3 藻种购买：淘宝 轮虫小球藻套装。40元/一套 4 接种 选用生活力强、生长旺盛的藻种，在天气晴朗的上午接种。一般状况下，作为第1级培养，可按藻液与培养液12的比例进行接种。接种的量大，可使藻种迅速成为培养液中的优势种，运用生物间的拮抗作用，减少了污染机会，缩短了小球藻的培养时间。待扩大培养时，可按藻液与培养液14的比例进行接种。 5 管理 5.1 搅拌 由于小球藻不能游动，只能浮在水中生活，因此必须对培养液进行搅拌，让藻体不断变换位置，使光照、养料和水温均衡，这样有助于藻体的迅速生长和繁殖。常用的搅拌工具有玻璃棒、竹棒，每天搅拌3次，每次1分钟。 5.2 光照 小球藻的培养要有充足的光照，阴雨天光线局限性时，可在培养室内用人工光源进行补充，一般用冷白荧光灯，光照强度为3000Lx；但在光线强烈的夏天，要用遮阳网等进行合适避光。 5.3 温度及pH 温度保持在2530，最合适生长温度为26。pH保持在68。 5.4 污染的防治 在小球藻的培养过程中，要常常观测藻液的颜色与否正常、与否有沉淀和附壁现象、液面与否有菌膜等异常状况。导致藻种污染的多数状况是原生动物及杂藻的生长。如果显微镜下检查有原生动物生活，可用1mg/L的漂白粉灭杀。对付其她杂藻最佳的措施是严格控温和常常检查培养液的pH。 6 采收当小球藻的培养液变成绿色、用显微镜观测1mL。培养液中大概有100个小球藻时，就可以采收或扩大再培养了。采收时，用0.3%0.5%的明矾粉溶解在培养液里，约1小时后，小球藻沉在了水底，除去上层的水，就能获得小球藻的浓缩液。二、硅藻1. 储存液：(1) 金属液（每升含） EDTA二钠 - 4.360 g 氯化铁晶体 - 3.150 g 五水硫酸铜 - 0.010 g 七水硫酸锌 - 0.022 g 六水氯化钴 - 0.010 g 四水氯化锰 - 0.180 g 二水钼酸钠 - 0.006 g(2) 维生素液（每升含） VB12 - 0.0005 g 维生素B5盐酸盐 - 0.1 g 生物素 - 0.0005 g2. 1L培养基配方：硝酸钠 - 0.075 g二水合磷酸二氢钠 - 0.00565 g金属液 1.00 ml维生素液 1.00 ml硅酸钠50mg加水至1L。 硅藻培养温度在22，光照照度在3000lux（不要太阳直射）以上。大量培养中曾浮现过杂藻污染问题,重要是浮游的蓝纤维藻及部分栅藻和小球藻。我们运用藻类比重、悬浮习性不同来排除杂藻。发现杂藻时,停止搅拌数小时,使硅藻下沉,蓝纤维藻等悬浮在水中。然后将上清液倾弃,再将沉淀硅藻用蒸馏水反复清洗几次后,加入新鲜培养基,即可获得纯化。补充：1藻种培养设施：藻种的培养要在保种室中进行，保种室规定通风条件好，光线条件好，温度可控性好，保种室要配有空调、冰箱、具有人工光源的培养架等。培养中常用培养仪器有显微镜、解剖镜等，容器有三角烧瓶、广口玻璃瓶等。保种室要严格消毒，避免病菌的侵入。2容器、工具的消毒：进行单细胞藻类的纯培养，容器、工具、培养基都要进行严格灭菌，但一般生产性的单种培养，则只须达到消毒目的就可以了。常用的消毒措施有高温消毒法和化学药物消毒法。高温消毒法是运用高温杀死微生物的措施。不耐高温的容器如塑料和橡胶制品等不能运用高温法消毒。a、直接灼烧消毒接种环、镊子等金属小工具，试管口、瓶口等可以直接在酒精灯火焰上短暂灼烧消毒。载玻片、小刀等则最佳先蘸酒精，然后在酒精灯火焰上点燃，等器具上的酒精烧完，也就完毕了灭菌操作。b、煮沸消毒把容器、工具放入锅中，加水煮沸消毒，一般煮沸10-20分钟。大型锥形瓶消毒，可在瓶口上放一一般的玻璃漏斗，再在漏斗上放一称量瓶盖，在锥形瓶内加少量淡水，置电炉上加热煮沸5-10分钟，可使整个瓶壁消毒。消毒完毕即用消毒的纸或消毒的纱布包扎瓶口。此法适合消毒小型的容器工具。c、烘箱干燥消毒将玻璃容器、金属工具用清水洗干净后，放入烘箱。关闭烘箱门，打开通气孔，接通电源加热。当温度上升到120时，关闭通气孔，停止加热。如果进行纯培养，容器必须灭菌，当温度上升到105时，关闭通气孔，继续加热至160，保持温度，恒温2小时，然后停止加热。必须要等到温度下降到60如下，才干打开烘箱门。有棉塞和纸包扎的容器、工具灭菌，不能超过180，以免烘焦。化学药物消毒重要用于生产性大量培养中，大型容器、工具、水泥池等常用化学药剂消毒。a、漂白粉消毒工业用漂白粉一般具有效氯25%35%，消毒时按万分之1-3的含量配成水溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小时，再用消毒水冲洗34次即可。b、酒精消毒酒精消毒常用于中小形容器和工具，措施是用纱布蘸70%酒精在容器、工具的表面涂抹即可。c、高锰酸钾消毒以百分之五的比例配成溶液把要消毒的容器、工具浸泡5分钟，然后取出用消毒水冲洗23次，便可达到消毒目的。如果是对玻璃钢水槽、水泥池等消毒，可以用高锰酸钾溶液拨在池壁上，拨洒几遍后刷洗池底，10分钟后再用消毒水冲洗干净。d石炭酸石炭酸消毒按3%5%的比例配成消毒液，把要消毒的容器和工具放在其中浸泡半小时，再用消毒水冲洗23次。微藻的培养液是在消毒的海水或淡水中加入多种营养盐配制而成。培养液的配制，一方面按配方先后称量多种营养物质，可逐个溶解，也可以同步溶解。遇到难溶的含金属的物质可以加热或与NaEDTA一起溶解，配方中的维生素一般等水温降至60后再加。生产上为了以便可以将营养盐配方浓缩1000-倍配成母液，使用时可以根据培养水体多少量取母液的体积即可。3培养液的制备和消毒：保种培养液的消毒一般采用加热消毒法，经沉淀、过滤的海水，一般加温至90左右维持5分钟或达到沸腾即可。由于海水中的某些对藻类生长有增进作用的有机物在高温时易遭破坏，因此加温时间不适宜太长。4接种：接种就是把作为藻种的藻液接入新配好的培养液中，进行丰富培养。选择无污染、生长旺盛、颜色正常、藻液中无沉淀、细胞无附壁的藻种进行接种。一般来说藻种液和新培养液的比例为1:2。接种的时间最佳在上午的810时，这个时间是藻类细胞代谢最旺盛的时候。培养条件:保种的条件最佳保证在藻种的最适生长条件，要保证藻种不受污染。5藻种培养：温度保持在2530。pH保持在68。6平常培养管理:1）注意保种室的卫生，定期打扫，谢绝无关人员的进入等；2）外观检查。检查藻液颜色与否不再浅变浓，或是浮现浑浊或沉降等反映藻体生长不正常，处在老化时期受到病虫侵染的现象。3）镜检检查与否发生污染，与否老化，以保证明验的顺利进行。4）控制温度。通过暖气控温装置控制温度，使实验藻细胞在合适的温度环境中。5）摇瓶。在培养过程中每天摇瓶1-3次,使藻均匀分布。6)调节光强。保持合适的光强，白天避免阳光直射。7藻种保藏措施：存藻种时可以根据保种目的和保种条件的不同分别采用不同的保种措施。1）固体培养基保存法。保种用的固体培养基的营养浓度应比正常的液体培养液的高，一般增长一倍。琼脂量为1-1.5%。固体培养基分装灭菌后，冷却待用。将无污染的藻种用喷雾法或划线法接种到固体培养基上。常用固体培养基保种措施有两种，一种一般把藻种接种在固体培养基上，在弱光低温条件下慢慢培养保存，接种一次可以保存半年到一年。另一种措施，接种后一方面放在光线充足的地方（避免直射光照射），使藻类细胞较迅速地繁殖起来，直到培养基上浮现颜色，即可放入冰箱或冷库中，一般在5左右的低温下保存。每天给藻种几种小时的弱光照。此法保存的时间可长达2至3年。2）液体培养基保存法。低温、弱光下培养。一般两个月更换一次培养液。淡水小球藻在国内的培养有几十年的历史，由于培养方式简朴，生长速度快，被誉为罐装的太阳，一度被大力推广。小球藻是哺育淡水轮虫的有效饵料之一。 淡水小球藻的培养，无非几种要素，光照、合适的温度、营养液。一方面说一下光照，一般是不小于4500lx，温度以25为最佳，在25-30度间都可以较好的生长，每20个小时就能分裂成4个细胞。那么第三个要素是营养液，而营养液无非就是氮源、磷源、碳源及某些微量元素，目前使用较多的营养液配方有BG-11、F/2、SE培养基等，同步强调一点，实验表白，合适补充尿素是增进小球藻生长的一种较好的方式，同步小球藻可以异养，合适添加葡萄糖可以缩短培养时间。藻种的获得很容易，但是建议用纯种的规范操作的藻种，好的种源是开口的第一步，目前藻种获得可以通过某宝直接搜索小球藻藻种购买，也可以通过向水生所采购，但是那里藻种普遍较贵，差不多1000大洋10ml左右，如果不是科研规定，不建议如此购买，尚有就是通过科研院校索要。一方面我们要获得小球藻藻种，这个某宝上有发售，也可以向科研院所购买，这个在此就不详述，一般藻种浓度在 百万 -千万个 /ML，接种藻种时，将 200-300ml 的藻种倒入到 1L 培养液中（推荐比例在 1：3-5 之间为宜） ，在瓶口加多层纱布培养，光照不小于 -4500 勒克斯，光强可以加大，温度在 25-30为宜。一般我们15 天左右需要继续扩培（如果是育苗急用的话，可以每 L 水中添加 0.3-0.4g 尿素，10g/L 的葡萄糖，光照在 4500LX ） 。其中的营养液可以是BG11、F/2、SE培养基等