分子诊断生物大分子的分离纯化

第三章 生物大分子的分离纯化生化教研室：辇晓峰Tel:18931316366 什么是生物大分子（biomacromolecule）生物大分子有何功能 为什么要分离纯化生物大分子 生物大分子是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。DNA和RNA是生物体的遗传物质。蛋白质是一切生命活动的物质基础。基因及蛋白的异常是人体疾病发生、发展的基础，故生物大分子的分离与纯化是分子生物学及分子诊断的最重要的基础工作。本章内容提要核酸的分离纯化原则及技术路线的设计（核酸浓度、纯度、完整性的检测方法及保存方法）原则及技术路线的设计（核酸浓度、纯度、完整性的检测方法及保存方法）真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化（提取总的分离纯化（提取总RNARNA的方法、制备的方法、制备mRNAmRNA的方法）的方法）蛋白质的分离与纯化 技术路线设计及条件技术路线设计及条件 材料选择与预处理材料选择与预处理 细胞破碎的方法细胞破碎的方法 蛋白质分离纯化方法蛋白质分离纯化方法 蛋白质样品的纯度鉴定蛋白质样品的纯度鉴定 蛋白质的定量和分子量测定蛋白质的定量和分子量测定 第一节 核酸分离纯化的设计及原则DNA +蛋白质 =DNP RNA +蛋白质 =RNP 核酸(核蛋白)真核生物 染色体DNA 核内 95%双链线性细胞器DNA 线粒体或叶绿体 5%双链环状原核生物 染色体DNA质粒DNA 双链环状nucleoprotein DNA病毒 双链环状、双链线状、单链环状、单链线状RNA病毒 双链线状、单链线状 基因组总长度一般随生物进化程度而增大。与DNA相比，RNA要小得多，其种类、大小和结构具多样化，主要存在于细胞质中。DNA对碱相对稳定，RNA对酸相对稳定，但不能极端。DNA与RNA理化性质及细胞定位的差异决定了二者最适分离与纯化的条件是不同的。一、材料与方法的选择 材料与方法的选择 来源多 核酸存在于动植物细胞及各种微生物之中。临床诊断常见的标本包括血液、尿液、唾液、组织及培养的细胞。分离纯化的方法多 核酸的完整性、纯度、产量及浓度 制备所需时间与成本 商品化的试剂盒与自动化仪 选择的原则 保持核酸碱基序列的完整性 完整的一级结构是核酸结构和功能研究以及基因诊断的最基本要求 尽量清除其他分子的污染，保持核酸制品 的纯度 满足后续研究及诊断的要求 保持核酸的完整性 整个操作过程中尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 物理：剪切力、高温 0-4 化学：酸、碱、有机溶剂 pH4-10 生物学：DNase及RNase 不可避免的有害因素要采取措施尽量减轻对核酸的破坏 简化提取纯化步骤、缩短分离时间，避免剧烈震荡；加入金属离子螯合剂抑制DNase活性，加入DEPC(二乙基焦碳酸盐)抑制RNase活性 细胞应完整，相关器皿及试剂应提前消毒二、技术路线的设计 核酸的释放裂解细胞释放核酸 机械法：剪切力对高分子量线性DNA的影响，不适用真核非机械法：溶胞法，柔和，较好保持核酸的完整性富集在细胞特定区域的核酸，一般先收集该部分核酸 核酸的分离与纯化 非核酸的大分子污染物 非需要的核酸分子 在分离纯化过程中前后加入的对后续研究与诊断有影响的溶液及试剂 分离纯化步骤多纯度越高得率下降完整性下降分离纯化步骤少保持完整性纯度越低结合用途，精心设计 核酸的浓缩沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。核酸的有机溶剂沉淀法的原理 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，当加入一定浓度的盐后，核酸分子与1价或2价阳离子形成盐，通过屏蔽带负电荷的磷酸基团，使DNA、RNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂，此外，这些盐在许多有机溶剂中亦不溶解，也不会被有机溶剂变性，因此常在加入一定浓度的盐后，用有机溶剂沉淀抽提液中的核酸。常用的盐类有NaAc、KAc、NH4Ac、MgCl2、KCl、NaCl 常用的有机溶剂为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀中常含有少量共沉淀的盐，需用70%乙醇洗涤去除。核酸的鉴定与保存 核酸的鉴定 浓度鉴定 1）紫外分光光度法 原理：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可吸收紫外线，最大吸收波长为260nm。此法测定核酸的灵敏度为0.25g/ml。在波长260nm紫外光下，1.000A260（1OD值）的吸光度相当于50g/ml双链DNA；1.000A260=33g/ml单链DNA；1.000A260=40 ug/ml单链RNA 若DNA样品中含盐，会使A260偏高。此时必须测定A310以扣除背景，以 A260 A310的差值作为定量计算的依据。2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭（EB），嵌入碱基平面，在UV激发下发出红色荧光，强度与含量呈正比。该法灵敏度高达1-5ng。新型超灵敏荧光染料SYBR Gold可检出低至20pg的ds-DNA核酸的鉴定纯度鉴定 1）紫外分光光度法A260/A280的比值来判断有无蛋白的污染。纯的DNA样品A260/A280应为1.8，纯RNA该比值为2.0。比值的升高与下降均提示不纯。蛋白质（A280）、酚（A270）使比值下降。RNA的污染可致DNA制品比值高于1.8，故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液，需结合其他方法加以鉴定。对于RNA来说，A260/A280为2是高质量的标志。二级结构的不同会使比值在1.8-2.1波动。鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响比值。因此应使用水溶液并加空白对照来测定计算该值。2）荧光光度法 用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子比RNA大得多，电泳迁移率低。总RNA中，rRNA最多（80-85%），tRNA等占15-20%，mRNA1%-5%。总RNA电泳后呈现三条特征性区带 原核生物：23S 16S 5S rRNA和tRNA（宽的快迁移带）真核生物：28S 18S 5S、5.8S rRNA和tRNA 分析电泳结果，可鉴定DNA中有无RNA的存在，也可鉴定RNA中有无DNA的污染。完整性鉴定 1）琼脂糖凝胶电泳法 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段：分子量大，泳动慢，如发生降解，电泳图呈拖尾状。总RNA电泳图谱，三条带荧光强度呈特定比值，沉降系数大的电泳迁移率低，荧光强度高。28s(23s)RNA荧光强度约为 18s(16s)的2倍，否则提示有RNA的降解。若在加样孔附近有着色条带，说明有DNA的污染。核酸的保存(2)对RNA样品的保存方法 RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存;(1)对DNA样品的保存方法 DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存 （Tris-HCl、EDTA、加入少量氯仿可有效避免细菌及霉菌的污染）（3）由于反复冻融产生的剪切力对核酸有断裂作用，实际储存时最好将核酸小剂量分装冻存。第二节 真核基因组DNA的分离纯化 基因组来源、性质以及制备的目的不同，分离方法不尽相同 分离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试剂及其作用原理是一样的生物体组织细胞细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放酚抽提法玻棒缠绕法甲酰胺解聚法基因组DNA粗品AGE分离PFGE分离PAGE分离特定的DNA片段有机溶剂抽提离子交换层析纯化乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品前处理粗分离精分离哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线分离纯化的一般技术路线酚抽提法 含EDTA、SDS及无DNase的RNase裂解液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得DNA粗制品。EDTA：二价金属离子螯合剂，可抑制DNase的活性，同时降低细胞膜稳定性 SDS：阴离子去垢剂，主要溶解细胞膜、核膜，并乳化脂质、膜蛋白及胞内蛋白，并使他们沉淀变性，并将组蛋白和非组蛋白从DNA分子上拉开，同时兼备变性DNase的作用 无DNase的RNase：可高效水解RNA而避免DNA的消化。蛋白酶K：广谱蛋白酶，在SDS存在下保持很高的活性，可以消化DNA酶和胞内的蛋白质 酚：变性沉淀蛋白质，也抑制DNA酶活性 pH8.0的Tris溶液：能保证抽提时DNA进入水相，而避免留在蛋白质的沉淀层，同时pH8.0可防止DNA变性。甲酰胺解聚法 细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解染色质中DNA与蛋白质，然后用火胶棉袋进行充分透析去除蛋白酶K及有机溶剂。操作步骤少，可获得更大片段的DNA 需充分透析，耗时，且所得DNA浓度低。玻棒缠绕法 两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上，从而将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE缓冲液中。基因组DNA片段的纯化 分子量大小不等的DNA片段的混合物，难免有少量RNA、蛋白质或一些小分子杂质。纯化方法：透析、层析、电泳及选择性沉淀。电泳：聚丙烯酰胺凝胶（PAG）：分辨率高，电泳容量大，回收的核酸纯度高。制备困难，只适合小片段DNA的纯化。琼脂糖凝胶（AG）：分离范围广。纯化的原则与要求 两个原则：提高片段的回收率；清除回收的DNA样品中的杂质。回收率：通过提高上样量 纯度：有机溶剂抽提法 商品化的柱层析法去除杂质 从AG中回收DNA片段 1）DEAE-纤维素膜插片电泳法 将DEAE-纤维素膜插入到经AGE分离的DNA区带前，继续电泳直至所需DNA片段刚好转移到膜上。取出膜片，低盐下洗去杂质，高盐洗脱出DNA分子。2）电泳洗脱法 把所需DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的小体积溶液中，然后分离纯化出DNA片段。3）冷冻挤压法 切下含回收DNA的凝胶块置液氮罐中快速冷冻、融化，然后挤压，榨出的缓冲液中含有所需DNA。快速廉价，但回收率低。4）低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 从低熔点琼脂糖凝胶中切下含待回收的DNA凝胶块，利用其纯度高、熔点低（65）及凝固点低（30 ）的特点，比如温育，对DNA片段进行回收的方法。从PAG中回收DNA片段 压碎与浸泡法：将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。第三节 质粒DNA的提取与纯化 碱裂解法 原理：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；强碱条件下，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；操作简单，重复性强，成本低，制备量可大可小，是最广泛使用的方法。煮沸裂解法：原理：细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，二者能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA变性，质粒DNA因结构紧密不会解链，冷却时即恢复其天然构象，通过离心将两者分开。SDS裂解法：原理：细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细胞，温和地释放质粒到等渗液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。产率不高。质粒DNA的纯化 质粒DNA往往有RNA与不等量的染色体DNA污染。1）CsCl-EB法 原理：经超速离心，离心介质CsCl形成一连续地密度梯度，在过量EB存在下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。蛋白质由于密度小而浮于液面，RNA密度大沉于管底，各种DNA的密度介于蛋白质和RNA之间，处于中部。费时，需昂贵的设备与试剂 2）聚乙二醇沉淀法 原理：分级沉淀法。质粒DNA粗制品首先用LiCl沉淀去除大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA，然后在高盐条件下，用PEG选择性沉淀质粒DNA，沉淀用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀、洗涤。简单、经济、适用广泛，尤其对碱裂解法提取的质粒DNA纯化效果好。柱层析法：填充柱层析的树脂 利用疏水作用 通过离子交换与吸附作用第四节 真核细胞RNA的分离纯化 RNA制备的条件与环境 RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围环境中；且生物学活性非常稳定，加热及一般变性剂均不能使其完全灭活，而且去除变性剂后活性又可恢复。因此，在RNA制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。实验室清洁 操作人本身，戴手套口罩 实验用试剂器材应严格选择，尽量选用一次性和新包装的化学试剂，并对各种材料和试剂进行严格洗涤和消毒等处理 所用玻璃器皿与溶液均应用RNase的抑制剂DEPC进行处理，并于处理后去除残留的DEPC。在冰浴条件下进行操作，降低RNase活性。内源性RNase：选择性使用 RNase的变性剂及特异性的抑制剂。使用pH4.5-5.5的水饱和酚，既利于DNA的变性又利于RNA的分离。1）酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离总RNA 以含异硫氰酸胍、-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的条件下，用酚/氯仿抽提细胞裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。2）商品化的单相裂解试剂法分离总RNA 是前一方法的改进方案。成为实验室最常用的总RNA的提取法。mRNA的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端有长短不同的poly(A)尾巴。利用碱基配对原则，通过oligo（dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析可较容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA oligo（dT)-纤维素柱层析法 oligo（dT)-纤维素柱离心法 oligo（dT)-纤维素液相结合离心法 磁性球珠分离法 其他方法第五节 蛋白质的分离纯化 总目标：增加制品的纯度或比活 实际中，多数分离纯化工作都使用基本的技术手段，涉及相似的技术步骤。生物体组织细胞组织粉碎细胞裂解蛋白质释放 DNA释放离心分离蛋白质粗抽提液盐析法凝胶层析等电点沉淀法蛋白质粗制品亲和层析离子交换层析电泳分离蛋白纯品前处理粗分离精分离蛋白质分离纯化的一般技术路线蛋白质分离纯化的一般技术路线组织粉碎细胞裂解蛋白质释放 DNA释放有机溶剂沉淀法（一）技术路线的设计 1）要建立一个适当的分析方法，才能评估每一步的提纯纯度。四个标准：特异性强、灵敏度高、准确度高、使用方便，快捷 2）材料的选择与预处理 靶蛋白含量较高的材料适当预处理，然后组织粉碎、细胞裂解并释放蛋白，离心将亚细胞颗粒分开并制备无细胞粗抽提液 3）蛋白质的粗分离 各种层析方法（亲和、凝胶离子交换）对蛋白粗制品进行进一步分离纯化。如未达到纯化要求，再进行电泳纯化，最后得到靶蛋白的纯品。5）靶蛋白的浓缩、冷冻干燥和保存 沉淀法：处理大体积样品，同时还有浓缩蛋白质的作用，常用于早期提纯 柱层析法：处理的样品体积受到限制，但不像电泳法那么严格，故常用在纯化过程的中间 电泳法：用在提纯的后期，此时杂质少，处理的体积也小。离心法：早期提纯，也用于中间 尽可能减少工序、提高效率，在低温进行（二）分离纯化的总体原则 保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白的变性 尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求 纯度 产率蛋白质分离纯化的条件 缓冲液 提纯过程中始终控制pH，动物细胞（7.0-7.5）盐、金属离子和螯合剂 稀盐溶液模拟生理状态下离子强度 二价金属离子（镁、钙）的去除视情况 还原剂 含巯基的蛋白被氧化而失活，加入巯基乙醇或二硫苏糖醇。去垢剂：双极性分子，溶解细胞膜。与溶解性差的蛋白质的疏水区或穿膜区结合并覆盖于蛋白质分子上，成簇的去垢剂分子将亲水性头部向外，使其能与水溶性缓冲液或抽提液相溶 去垢剂与靶蛋白会形成微胶粒，为使靶蛋白更好地溶解且保持其活性，选择合适的去垢剂。增溶剂：样品溶解的不好会减少分离到的蛋白质数量，同时会造成某些蛋白质的沉淀，故需要加入增溶剂，如一定浓度的盐酸胍、尿素或硫尿等。蛋白酶抑制剂 裂解细胞提取蛋白质的同时，会释放出多种蛋白酶，需要迅速有效地抑制他们的活性，方能保持靶蛋白的完整性。低温、降低缓冲液pH可降低蛋白酶活性，但最重要的是加入相应的蛋白酶抑制剂，有时需几种抑制剂混合使用。如胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂等。蛋白质的环境因素 分离纯化体系环境与天然存在体系极不相同，如表面效应，加入牛血清白蛋白；温度的影响，低温操作；储存，溶液状态，保持一周，最好办法是以冻干粉末保存。加入甘油、白蛋白等惰性稳定剂，有利于长期保存。二、材料的选择与预处理 原则：所含靶蛋白量高；材料易得 预处理：剔除结缔组织、脂肪组织，取出的器官和组织要迅速处理，充分脱血后即刻使用或在冷库中保存。材料是培养的细胞时，裂解细胞前要充分洗涤，再离心收集细胞。细胞破碎的方法(1)机械法：1)研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。2)组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。(2)物理法：1)反复冻融法：将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。3)压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。蛋白质的分离纯化方法 依据：溶解性、分子质量大小及形状、电离性质和生物学功能的差异 以溶解度差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶 以分子质量大小及形状为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等 以电离性质和生物学功能为依据的方法：亲和层析 Western 印迹技术蛋白质样品制备SDS-PAGE分离蛋白质的电转移靶蛋白与抗体的结合显色、分析蛋白质样品的纯度鉴定 蛋白质纯度一般指是否含其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内，一定条件下的相对均一性。PAGE、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦电泳及高效液相色谱 至少应有两种以上方法，而且是两种分离原理不同的方法来判断蛋白质的纯度 最终的纯度标准当然是唯一的氨基酸顺序，但很少用它来鉴定纯度蛋白质的定量和分子量测定 蛋白质的定量指测定溶液中的蛋白质浓度。最早经典的凯氏定氮法，目前极少使用。双缩脲法、福林-酚、紫外吸收法和考马斯亮蓝法。蛋白的纯化程度常用这一特定成分的含量（用活力单位）与总蛋白量（质量单位）之比来表示。确定了蛋白质的均一性后，需要测定蛋白质的分子质量以及亚基和寡聚体的分子质量。常用方法：超离心沉降速度法、超离心沉降平衡法、凝胶过滤层析法及SDS-PAGE。不论哪种方法，都要求样品均一，否则测得结果不可靠。