CD4+和CD8+T 淋巴细胞检测操作细则

CD4+和CD8+T淋巴细胞检测操作细则1. 目的根据全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）,对CD4+和CD8+T淋巴细胞检测（流式细胞仪FACSCalibur）的操作进行细化， 以规范本中心CD4+和CD8+T淋巴细胞检测工作，保证结果准确。2. 适用范本操作细则适用于本中心CD4+和CD8+T T淋巴细胞检测。3. 职责3.1检测人员负责按本操作细则进行CD4+和CD8+T T淋巴细胞检测。3.2复核人员负责对CD4+和CD8+T T淋巴细胞检测操作及结 果进行复核。3.3科室负责人负责对检测工作进行综合管理。4. 操作程序4.1方法：流式细胞仪单平台法。4.2设备生物安全柜、振荡器、移液器、流式细胞仪FACSCalibur.4.4 试剂：经国家食品药品监督管理局注册批准，批批检合格， 在有效期内的商用CD4+和CD8+的检测试剂。4.5检测步骤4.5.1标本制备：4.5.1.1将试剂盒取出置于室温，平衡30分钟。然后按需要取出相应数目的绝对计数管TruCount Tube,按顺序依次编号。4.5.1.2用反向加样法在Tube中加入50uI充分混匀的抗凝全 血，注意血不要碰到试管底部的微球（Beads ）4.5.1.3取20ul荧光抗体加入到管中，注意：不要碰到血。涡旋 混匀，室温避光放置15min。4.5.1.4取出加入450ul lxFACS溶血素，充分混匀，避光 放置15mino4.5.1.5 24小时内上机用MultiSET软件获取细胞进行检测，上 机前应充分混匀。4.5.2.FACSCalibur 机操作：4.4.2.1执行FACSCalibur开机程序，进入MultiTEST软件。4.4.2.2在出现的Sign in窗口中输入操作者姓名、单位、领 导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息，单击Accept4.4.2.3 进入Set up” 窗口 ：在Data Source对话框中选 择From Cytometer: Acquisition and Analysis ,在Entry Level File Name Prefix 中选择Sample name;在Automatic Saving Options” 中选择Data File. Laboratory Report. Physician Report软件会自动生成一个文件文件的默认路径FacstationBD file Multiset DDMMYY文件夹；在View Reports中选择Until NextButton Pressedo4.4.2.4 单击Accept，进入FACSComp窗口，单击Skip FACSCompo4.4.2.5 进入Test Prefs 窗口，在Physician Report Choices” 中，这一项可以是全选，运行了一种试剂，会自动报告相应的结果。在窗口的最下方点Lot Ids”跳出一窗口，点此窗口左侧的Absolute Count Beads”，在此窗口右侧输入TruCount tube的批号和Beads 总数（标在包装袋上），单击“Save”单击“Accept”4.426进入“Samples”窗口，在表格中输入相应的PatientName、ID、Case Number，在 Panel 中选择 CD4/8/3 Truc.4.427在窗口最上方的“ Cytometer”的下拉菜单中，单击 “Instrument Setting”，在出现的新对话框中单击“Open” ；打开 此路径下 FacstationBD file Instrument Setting Calibur.LNW文 件。调用仪器各个参数的条件，选好后单击“Set”，“Done” .4.428单击“Run Tests，上样，调整SSC电压和阈值后，单 击 “Acquire”4.4.2.9 获取完成后，可以人工调整各个门的大小，单击 “Continue”打印Phys Report。继续下一个实验或单击Quit” , “Don t Save”，退出 MultiTest软件。4.4.2.10 执行 FACSCalibur 关机机程序后，依次关闭电脑、仪 器、稳压器、变压器。4.4.2.11 将仪器的压力阀打到减压位置。4.5.4注意事项4.5.4.1样本使用EDTA抗凝全血，室温放置，24小时内处理， 处理前充分混匀。4.5.4.2 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到 第二档，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。4.5.4.3 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀过程中， 尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。4.5.4.4 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工 作效率和计数精确度。4.5.4.5 TruCOUNT 管 2-25C 保存，从冰箱取出后，应恢复室 温再打开封条，保证 TruCOUNT 管包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉 红色时，TruCOUNT管应弃去不用.4.5.4.6 遵守 HIV 实验管理规范和生物安全守则。4.5.4.7 严格防止交叉感染，操作时必须戴手套，穿着工作衣。4.5.4.8 所有样品，洗涤液和各种废物、弃物都按传染物处理。4.549 4剩余样品及废弃物应经12TC高压20分钟或用次氯 酸钠等消毒剂处理 30 分钟，方可带出实验室。4.5.4.10 每次实验完毕，用消毒液清洁工作台。5. 支持性文件5.1全国艾滋病检测技术规范（2009 年修订版）。5.2 流式细胞仪 FACSCalibur 中文操作手册和试剂使用说明书。