《SDSP-AGE凝胶电泳》PPT课件.ppt

SDS-PAGE凝胶电泳,SDS-PAGE凝胶电泳,实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧,实验步骤,试剂配制 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。 4，12月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)： 称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。,（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8): 称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （）TEMED（四甲基乙二胺）,（）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml （）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀 （）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用,（1）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml （1）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml,. 聚胶前准备,(1) 配制10过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制)。 (2) 将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。 (3) 将灌胶装置准备好。 (4) 待凝胶溶液平衡至室温(2325)后，真空脱气15 min。,不连续系统下层分离胶的聚合,在10 ml凝胶溶液中加入10过硫酸铵50 l (最终浓度为0.05)，TEMED原液5l (最终浓度为0.05)。轻缓地摇动溶液(810下)，使激活剂混合均匀。 将凝胶溶液平稳地注入两层玻璃板中(注意要以连续平稳的液流从中间位置注入)，再在液面上小心注入一层水或正丁醇(约23mm高)，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置至少90 min。,不连续系统中的上层浓缩胶 和连续系统凝胶的聚合,连续系统只含一种凝胶，它和不连续系统中的浓缩胶具有相同之处，即在其液面处与空气相接触，因此激活剂的含量应相应地增加，在10m1凝胶溶液中加入10过硫酸铵50 l (最终浓度0.05)，TEMED原液10 l (最终浓度0.1)。,同前将激活剂混合均匀，但摇动溶液时不要摇得过于剧烈以免引入过多的氧气。 吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡。 静置90 min以上以保证完全聚合。 如果在聚胶过程中发现一道道纹线，即凝胶不均匀，可能是聚合速度太快或激活剂未充分混合导致局部浓度过高。,凝胶聚合的速度可以通过紫外吸收检测，由于丙烯酰胺中的双键在260nm有吸收，聚合后双键消失，光吸收减低。将凝胶溶液倒入石英比色杯中，可观察到2030 min后光吸收读数开始下降，至80 min以后趋于稳定，说明聚合完成。,电泳,将聚合好的凝胶板安置于电泳槽中，上样，选择适当的电压进行电泳。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,染色和脱色,电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣，此外根据不同的研究目的，也可将凝胶直接进行放射自显影及电印迹。,电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片,.结果处理,测量并计算分子量 蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式 Mw K(10bm) (1) lgMw = lgKbm = K1bm (2) 其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数 b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。 mR=dpr/dBPB,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,实验注意事项,1. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：丙烯酰胺、线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。 2. 注意不能随便倾倒单体溶液，应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。,3. TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化产物呈黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。,4. 过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂凝胶)。,5. 激活剂的用量: 激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。,6. 温度的影响聚胶的最佳温度为2325 ，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。,7. 氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度(125torr)脱气至少15 min 。,8. 凝胶添加剂：凝胶中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加剂。SDS加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。,9. 聚胶时间：虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520 min即可观察到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时间(完全聚合需8 h)。,10. 单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。,12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10误差，不可完全信任。 13. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。,14. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 15. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。,常见问题及处理办法,纹理和拖尾现象由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。 蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。,电泳时间比正常要长 可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。 指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。,.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全 .凝胶时间不对通常胶在30min内凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，AP试剂不够或者失效,7.出现“皱眉”（两边向下中间鼓起） 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。,8.出现“鬼带” 如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。,9.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。,SDS-PAGE的优点,设备简单 快速 分辨率和灵敏度高 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定,SDS-PAGE的缺点,1. 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。,SDS-PAGE的缺点,2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在SDS-凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。,小技巧,1： 电泳缓冲液的使用： 电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前提是每次的内层缓冲液必须是新配的。每次在电泳完成后内外层缓冲液一起回收到一个瓶里，作为下次的外层缓冲液使用。就是配制新的缓冲液只作为内层使用（配制1L可以用很久的），每次都用回收的缓冲液作外层，效果一点都不差，即节省了试剂，又节省了时间。,2： 电泳条件的选则 电泳不采用先低压再高压的常用方法，每次都是上样后直接采用200V恒压电泳，一般BioRad的胶板，39min即可跑到头，电泳结果一点都没有影响。,3： 染色与脱色 分子克隆上介绍的方法耗时太长，现在用Crystal的方法已经相当快了，稍做改动：染色时加入染液后，在微波炉中煮沸一次即可，切记不要喷了，这个过程大约2030秒，在摇床上染色，这时可以去处理胶板，电泳槽，台面，待收拾干净后染色也就结束了（不要觉得染色时间太短了，已经足够了，太长了脱色也麻烦），此过程大约需要35min；回收染液，用自来水清洗几次胶，再加入适量自来水，放入微波炉中煮沸，条件与染色时一致，摇床脱色，此时你就可以做其他试验了， 35min后可以再换一次清水，煮沸脱色，我的经验是一次用水脱色就可以看到Marker条带了，两次以后就可以清析的看到你的结果了，如果觉得结果不错可以留存备用，再加入脱色液，脱干净了就行了。,Thanks For Your Attention!,