分子生物学7核酸分子杂交

周坤福周坤福核酸分子杂交核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）是指具有互补序列的两条核酸单链在一是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。程。杂交双方分别称为探针与待测核酸。杂交双方分别称为探针与待测核酸。杂交分子：杂交后形成的异源双链分子杂交分子：杂交后形成的异源双链分子核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 是指用是指用标记标记的的已知已知DNA或或RNA片段片段检测检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的色的方法，将结合的核酸序列的位置位置或或大小大小显示出来。显示出来。是目前生命科学研究领域中应用最广泛是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测的技术之一，是定性或定量检测DNA或或RNA序列片段的有力工具。序列片段的有力工具。核酸探针核酸探针(probe)：带有可检测标记的已带有可检测标记的已知序列的互补知序列的互补DNA或或RNA片段。通常用片段。通常用核素或非核素示踪标记。核素或非核素示踪标记。第一节第一节 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理第二节第二节 核酸探针核酸探针第三节第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术第一节第一节 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列的两条单链核酸分子在一具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在碱基互补配对结合，重新形成双链；在这过程中，核酸分子经历了变性和复性这过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。形成和断裂等。一、变性（一、变性（denaturation）2变性的因素：变性的因素：加热、酸、碱、某些理化试剂（如尿素、甲酰胺）加热、酸、碱、某些理化试剂（如尿素、甲酰胺）增色效应增色效应（hyperchronic effect）：核酸变性时，紫外吸收值）：核酸变性时，紫外吸收值A260随之升高的现象。随之升高的现象。1概念：概念：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，有规则的结构被破坏，双股螺旋断裂，疏水作用被破坏，有规则的结构被破坏，双股螺旋（NDA）或发夹结构（）或发夹结构（RNA）打开，形成单链分子。）打开，形成单链分子。变性的因素 除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主要的是DNA分子中GC的含量，GC含量高的DNA不易变性，而AT含量高的DNA容易变性。另外环状DNA比线性DNA难于变性。3.常用变性方法常用变性方法(1)热变性热变性DNA的熔解曲线的熔解曲线Tm值值（melting temperature）:热变性时，热变性时，50%DNA分子变性的温分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。度。又叫解链温度、熔解温度。Tm=(G+C)%0.41+69.3热变性 当温度70，DNA几乎不变性；当温度介于7090时，DNA部分变性；当温度90，DNA完全变性；当温度100，DNA双链分离；通常核酸的变性温度可选在90100之间。(2)酸碱变性 当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子；在分子杂交中最常用的核酸变性方法是碱变性（因为核酸的载体物如凝胶或膜对热不稳定）(3)化学试剂变性 当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲酰胺、甲醛等时，双链间的氢键可以断裂形成单链核酸分子二、复性二、复性（renaturation）概念：概念：在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条互补单链通过碱基互的两条互补单链通过碱基互补配对原则重新缔合，形成双链的过程（又称杂交）。补配对原则重新缔合，形成双链的过程（又称杂交）。热变性后，热变性后，缓慢降低温度缓慢降低温度至比至比Tm值低值低20-30时，变性时，变性的单链的单链DNA可恢复其双链结构，称为可恢复其双链结构，称为退火退火（annealing）。相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条核酸链之间，如顺序的两条核酸链之间，如DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA或人工合成的寡核苷酸片段与或人工合成的寡核苷酸片段与DNA、RNA等。等。v 单链核酸的起始浓度单链核酸的起始浓度v 核酸链长度（分子量）核酸链长度（分子量）v 核酸分子的复杂性，即核酸分子中不同序列的总长度核酸分子的复杂性，即核酸分子中不同序列的总长度v 温度温度v 离子强度离子强度影响复性的因素：影响复性的因素：三、杂交三、杂交（hybridization）2影响核酸分子杂交的因素：影响核酸分子杂交的因素：核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度温度温度离子强度离子强度变性剂（甲酰胺）变性剂（甲酰胺）核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性非特异性杂交反应非特异性杂交反应1概念：概念：来源不同来源不同的两条的两条单链单链核酸分子通过碱基互补可形成异源核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋。如双螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。杂交分子。杂交温度：杂交温度：温度一般选择低于温度一般选择低于 Tm值值20-25 Tm=81.5+161.6logM+0.41+161.6logM+0.41（G+CG+C）%-500/n%-500/n-0.61-0.61（甲酰胺（甲酰胺%）M为为Na+摩尔浓度，摩尔浓度，n为探针的复杂性为探针的复杂性 例如，一个长度为例如，一个长度为500bp的探针，（的探针，（G+C）含量为）含量为50%，杂交体系中含，杂交体系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和）和50%甲甲酰胺，则其酰胺，则其Tm值为：值为：Tm=81.5+(-2.07)+20.5 1 30.5=68.4 +(-2.07)+20.5 1 30.5=68.4 杂交温度应杂交温度应:68.4 -25=43.2:68.4 -25=43.2 实际的杂交反应中，实际的杂交反应中，水溶液：杂交反应温度为水溶液：杂交反应温度为68 50%甲酰胺溶液：杂交反应温度为甲酰胺溶液：杂交反应温度为42甲酰胺甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的降低核酸杂交的Tm值，值，50%的甲酰胺可以使的甲酰胺可以使Tm降低降低30寡核苷酸探针杂交反应寡核苷酸探针杂交反应 Tm=4 G+C）+2+2（A+TA+T）杂交反应温度为杂交反应温度为 Tm-5 -5 变性、复性、杂交示意图变性、复性、杂交示意图变变 性性复复 性性探探 针针四、预杂交四、预杂交（prehybridization）1概念：概念：为了减少探针与膜等的非特异性结合，在杂交前用为了减少探针与膜等的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭，该过程称为预杂交。封闭物将这些非特异性位点封闭，该过程称为预杂交。2常用的封闭物：常用的封闭物：（1）变性的非特异性）变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺、小牛胸腺DNA，又称为覆盖又称为覆盖DNA。（2）高分子化合物：一般常用）高分子化合物：一般常用Denhardt溶液，包括聚乙烯吡溶液，包括聚乙烯吡咯烷酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖咯烷酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 第二节第二节 核酸探针核酸探针probe：带有可检测标记的已知：带有可检测标记的已知DNA或或RNA片段，用于片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。检测待测样品中的靶核酸序列。核酸探针的类型核酸探针的类型 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法 核酸探针的检测核酸探针的检测 按化学本质分：按化学本质分：DNA探针探针 RNA探针探针按标记物分：放射性标记探针按标记物分：放射性标记探针 非放射性标记探针非放射性标记探针按分子大小分：寡核苷酸探针按分子大小分：寡核苷酸探针 双链探针双链探针 单链探针单链探针核酸探针的类型核酸探针的类型双链探针：双链探针：包括基因组包括基因组DNA探针和探针和cDNA探针探针v 基因组基因组DNA探针：由基因组文库筛选探针：由基因组文库筛选标记标记v cDNA探针：由探针：由cDNA文库筛选文库筛选标记或者经标记或者经RT-PCR法法生成，生成，mRNA cDNA链链PCRPCR扩增扩增寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：常为常为18-30bp单链探针：单链探针：包括单链包括单链DNA探针和单链探针和单链RNA探针。探针。核酸探针标记方法核酸探针标记方法放射性同位素的选择：放射性同位素的选择：32P 优点：放射比活度高优点：放射比活度高 缺点：半衰期短（缺点：半衰期短（14.3D）、散射严重）、散射严重35S 优点：分辨率较高，半衰期长（优点：分辨率较高，半衰期长（87.4D）放射比活度高）放射比活度高 缺点：放射比活度只有缺点：放射比活度只有32P的的1/63H 优点：半衰期长（优点：半衰期长（12.3Y）、成像分辨率高，易于定位）、成像分辨率高，易于定位 缺点：活性低缺点：活性低放射性标记核酸探针：放射性标记核酸探针：32P或或35S同位素标记的单核苷酸同位素标记的单核苷酸（）（）（OH）HOH制备均一标记的制备均一标记的DNA探针探针（1）缺口平移法）缺口平移法（nicktranslation）由由DNA酶酶和大肠和大肠杆菌杆菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNA酶酶：在双链在双链DNADNA上随机打开若上随机打开若干个单链缺口，产干个单链缺口，产生生3-OH3-OH端端大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶：53DNA53DNA聚聚合酶活性；合酶活性；5353外切核酸酶活性外切核酸酶活性随机引物随机引物：含有各种可能含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。的混合物。46=4096DNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段片段：53DNA53DNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱3535外切核酸酶活外切核酸酶活性性 无无5353外切核酸酶活外切核酸酶活性性（2 2）随机引物法）随机引物法（random primingrandom priming）单链探针的标记单链探针的标记单链单链DNA探针：探针：利用利用M13噬菌体噬菌体载体合成载体合成 以以dsDNA为模板，利用噬菌体依赖于为模板，利用噬菌体依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶于体外转录合成，用于体外转录合成，用无无RNase的的DNA酶酶处理，处理，除去模板除去模板DNA单链单链RNA探针：探针：探针的末端标记探针的末端标记 在在55或或33端通过酶促反应加上标记物端通过酶促反应加上标记物 DNA聚合聚合酶酶KlenowKlenow片段标记法片段标记法 T T4 4 DNA聚合酶聚合酶标记法标记法 T T4 4多核苷酸激酶标记法多核苷酸激酶标记法 末端脱氧核苷酸转移酶标记法：末端脱氧核苷酸转移酶标记法：ddNTPddNTP为底物为底物DNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段标记法片段标记法T T4 4DNA聚合聚合酶酶标记法标记法T T4 4多核苷酸激酶标记法多核苷酸激酶标记法ATPADP32P非放射性标记核酸探针非放射性标记核酸探针生物素化核苷酸生物素化核苷酸1.生物素生物素(biotin)标记标记标记方法：标记方法：（2）光敏生物素标记法光敏生物素标记法：强光：强光10-20分钟分钟 光敏生物素的结构光敏生物素的结构（1）酶促标记法酶促标记法：缺口平移法、随机引物法、末端标记法（缺口平移法、随机引物法、末端标记法（T T4 4 DNA聚合聚合酶酶标记法不能使用）标记法不能使用）2地高辛地高辛(digoxigenin)标记法标记法dig-dUTP的结构的结构酶促标记法酶促标记法：dig-dNTP缺口平移法、随机引物法、末端标缺口平移法、随机引物法、末端标记法（记法（T T4 4 DNA聚合酶聚合酶标记法不能使用）标记法不能使用）核酸探针检测方法核酸探针检测方法同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号 放射自显影是指利用放射线在放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来线片的成影作用来检测杂交信号。检测杂交信号。取出杂交膜，在取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒线片上，加增感屏，固定于暗盒内，内，-70曝光适当时间（曝光适当时间（1-7天），在暗室中取出天），在暗室中取出X线线片，显影、定影，即可在片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。线片上读出杂交带。非放射性标记探针：酶联显色非放射性标记探针：酶联显色Dig：半抗原，可通过半抗原，可通过抗原抗体反应抗原抗体反应系统与系统与显色体系显色体系偶联偶联Dig-DNA探针探针+抗抗Dig抗体抗体-碱碱性磷酸性磷酸酶酶（或（或辣根过氧化物辣根过氧化物酶）酶）+底物底物（1）偶联反应）偶联反应生物素生物素：可与抗生物素蛋白（卵白素）或链亲合可与抗生物素蛋白（卵白素）或链亲合素结合，再与素结合，再与显色体系显色体系偶联偶联 生物素探针生物素探针+抗生物素蛋白抗生物素蛋白-酶酶+底物底物 生物素探针生物素探针+抗生物素抗体抗生物素抗体+抗生物素抗体的抗抗生物素抗体的抗体体-生物素生物素+ABC试剂试剂（2）显色反应）显色反应酶法酶法：通过酶促反应使其底物形成有：通过酶促反应使其底物形成有颜色颜色的反应产物的反应产物碱性磷酸酶：碱性磷酸酶：BCIP（5-溴溴-4氯氯-3吲哚磷酸盐吲哚磷酸盐-4-甲基胺蓝）甲基胺蓝）NBT（四氮唑蓝）（四氮唑蓝）辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：DAB（二氨基联苯胺）（二氨基联苯胺）红棕色红棕色TMB（四甲基联苯胺）（四甲基联苯胺）蓝色蓝色第三节第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 膜上印迹杂交膜上印迹杂交 核酸原位杂交核酸原位杂交一、膜上印迹杂交一、膜上印迹杂交 印迹技术印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。相支持物上的方法。指将待测核酸序列结合到一定的指将待测核酸序列结合到一定的支持物支持物上，然后与上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。1固相支持物的选择固相支持物的选择特点：特点：较强的结合核酸的能力较强的结合核酸的能力;与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应;与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等 操作过程而不脱落操作过程而不脱落;非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉;具有良好的机械性能具有良好的机械性能 常见的固相支持物：常见的固相支持物：硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane）：）：尼龙膜（尼龙膜（nylon membrane）：）：化学活化膜：聚氟偏乙烯膜（化学活化膜：聚氟偏乙烯膜（PVDF膜）膜）2印迹方法印迹方法虹吸印迹法虹吸印迹法真空转移法真空转移法电转移法电转移法直接点印法（斑点、狭缝；菌落或噬菌斑）直接点印法（斑点、狭缝；菌落或噬菌斑）（1）虹吸印迹法）虹吸印迹法DNA片段片段15kb，18小时小时（2）真空转移法）真空转移法3060分钟分钟（3）电转移法）电转移法不宜用硝酸不宜用硝酸纤维素膜纤维素膜一般一般23小时，最多小时，最多6 8小时小时3印迹类型印迹类型 Southern印迹杂交印迹杂交 Northern印迹杂交印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 反向斑点杂交反向斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜，高温烘烤膜，高温烘烤与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影Southern blotting hybridization 检测靶分子为检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目检测靶分子是否含有目的基因。的基因。可用于基因组基因可用于基因组基因的定性及定量分析、克的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。基因突变分析等。预杂交预杂交预杂交：预杂交：杂交袋，杂交袋，42或或68 水浴，轻微振荡水浴，轻微振荡4-12小时小时 预杂交液：预杂交液：6SSC、0.5%SDS、5 Denhardts液、液、100g/ml变性的鲑鱼精子变性的鲑鱼精子DNA。杂交：杂交：杂交袋，杂交袋，42或或68 水浴，轻微振荡水浴，轻微振荡 杂交液：杂交液：6SSC、0.5%SDS、5 Denhardts液、液、100g/ml变性的鲑鱼精子变性的鲑鱼精子DNA、变性的探针。、变性的探针。洗膜：洗膜：取出杂交膜，按先高盐后低盐溶液进行漂洗。取出杂交膜，按先高盐后低盐溶液进行漂洗。室温室温，2SSC、0.1%SDS中洗膜中洗膜2次次/15分钟，轻微振荡分钟，轻微振荡 68 ，0.2SSC、0.1%SDS中洗膜中洗膜2次次/10分钟，轻微振荡分钟，轻微振荡 洗去未结合的、游离的探针，可能非特异性结合的洗去未结合的、游离的探针，可能非特异性结合的DNA 与与Southern Blot不同的是不同的是：1.不需要限制性核酸不需要限制性核酸酶切酶切;2.变性方法变性方法不是碱变性不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异特异mRNA的表达水平的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。因的表达情况。Northern blotting hybridization 检测靶分子为检测靶分子为RNA RNA极易被环境中存在的极易被环境中存在的RNase 降解，提取时要特降解，提取时要特别注意别注意RNase 污染问题。污染问题。直接直接将变性将变性DNA样品点于样品点于NC膜上，固定好后先预膜上，固定好后先预杂交，再与探针杂交。杂交，再与探针杂交。确定确定DNA样品之间的同源性或者两个克隆样品之间的同源性或者两个克隆DNA片片段是否来源于同一段是否来源于同一DNA样品。样品。dot and slot blotting hybridization优点：优点：简单、迅速简单、迅速 可在同一张膜上进行多个样品的检测可在同一张膜上进行多个样品的检测 核酸粗提样品的检测效果也较好核酸粗提样品的检测效果也较好dot blotting hybridizationslot blotting hybridizationreverse dot hybridization 直接将不同的直接将不同的探针点印并固定在膜上探针点印并固定在膜上，再将待测，再将待测的的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断断DNA是否含有这些探针的同源序列。是否含有这些探针的同源序列。DNA芯片芯片（DNA chip）：）：1995年斯坦福大学地年斯坦福大学地Schena M和和 Brown PO等发表第一等发表第一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵（microarrays）技术）技术DNADNA芯片的浪潮。芯片的浪潮。DNA芯片是将各种芯片是将各种“探针探针”固定在基质上，用于检测受固定在基质上，用于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。DNA芯片芯片（DNA chip）“探针探针”：载玻片：载玻片或或尼龙膜尼龙膜的表面原位合成寡核苷酸的表面原位合成寡核苷酸 DNA或或cDNA以高密度点阵固定排列在经处理过以高密度点阵固定排列在经处理过 的的载玻片载玻片或或尼龙膜尼龙膜的表面的表面 “样品样品”：标记了标记了荧光荧光或或同位素同位素待测靶核酸待测靶核酸 DNA DNA、cDNAcDNA或或RNARNA 在计算机控制的点样及强大的扫描分析硬件及软件的在计算机控制的点样及强大的扫描分析硬件及软件的支持下，可以在很小的载玻片或尼龙膜上固定数千甚至数支持下，可以在很小的载玻片或尼龙膜上固定数千甚至数万个万个“探针探针”，只需一次实验，就能够将成千上万要研究，只需一次实验，就能够将成千上万要研究的表达基因记录下来。的表达基因记录下来。应用：应用：基因诊断、分析基因组及发现新基因、基因表基因诊断、分析基因组及发现新基因、基因表达图谱的分析、遗传性疾病的分析、病原微生物的大规模达图谱的分析、遗传性疾病的分析、病原微生物的大规模检测等检测等。DNA芯片芯片（DNA chip）colony or phage hybridization 可以筛选大量细菌或噬菌斑中特异的可以筛选大量细菌或噬菌斑中特异的DNA序列，也可以在筛选重组序列，也可以在筛选重组DNA文库时检测出现文库时检测出现率很低的重组子。率很低的重组子。含有与探针互补序列的菌落或噬菌含有与探针互补序列的菌落或噬菌斑经放射自显影后，在斑经放射自显影后，在X X光底片上光底片上出现杂交点。出现杂交点。将转化后得到的菌落或噬菌斑原位将转化后得到的菌落或噬菌斑原位转移到转移到NCNC膜上，得到一个与平板菌膜上，得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品。落或噬菌斑分布完全一致的复制品。原位裂解细胞，碱变性，核酸分原位裂解细胞，碱变性，核酸分子被固定于膜上子被固定于膜上加入标记的加入标记的DNADNA或或RNARNA探针进行探针进行杂交杂交根据阳性反应位置，可从保留的母根据阳性反应位置，可从保留的母板上挑出所需的板上挑出所需的阳性克隆阳性克隆。二、核酸原位杂交（二、核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）用标记的已知核酸序列为探针，与用标记的已知核酸序列为探针，与细胞或组织切片细胞或组织切片中核中核酸进行杂交检测的方法。酸进行杂交检测的方法。每张标本所用杂交液较少，每张标本所用杂交液较少，20100l，为了避免杂交液，为了避免杂交液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒密闭的湿盒。在组织或细胞内进行在组织或细胞内进行DNA或或RNA精确精确定位和定量定位和定量。探针与分裂中期染色体探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究染色质中特定杂交，研究染色质中特定核酸序列在染色体中的精确定位；核酸序列在染色体中的精确定位；探针与细胞内探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定进行杂交，观察该组织细胞中特定基因的表达水平基因的表达水平；用用特异性的细菌、病毒的核酸特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进行作为探针对组织细胞进行杂交，确定有无该病原体的感染。杂交，确定有无该病原体的感染。应用：应用：The result of FISH 利用利用M13噬菌体体系合成放射性的噬菌体体系合成放射性的ssDNA探针探针。探针与待测探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA。核酸酶。核酸酶S1能专一能专一 性地降解未形成杂交的性地降解未形成杂交的DNA和和RNA单链，不降解单链，不降解DNA/RNA双链。双链。酚酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，在氯仿抽提，乙醇沉淀，在8 mol/L脲脲-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶中分离，放射自显影。胶中分离，放射自显影。三、液相杂交技术三、液相杂交技术1核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法（nuclease S1 protection assay）探针为探针为ssRNA，杂交后形成，杂交后形成RNA/RNA，RNA酶酶A和和T1专一性地降解专一性地降解ssRNA，而，而dsRNA不被降解。不被降解。酚酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，在氯仿抽提，乙醇沉淀，在8 mol/L脲脲-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶中分离，放射自显影。胶中分离，放射自显影。2RNA酶保护分析法酶保护分析法核核 酸酸 杂杂 交交 分分 类类 表表杂交方法杂交方法适适 用用 范范 围围Southern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上Northern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交检测未经分离的、固定在膜上的检测未经分离的、固定在膜上的DNA或或RNA分子分子菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释放出的放出的DNA分子分子原位杂交原位杂交检测细胞或组织中的检测细胞或组织中的DNA或或RNA分子分子