EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725

EMS 突变体致变基因鉴定在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外 反向遗传学也得到广泛应用。采用各种物理或化学突变，导致遗传物 质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。在众 多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变， 且遵循CT突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。常规的 对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位 克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。随着高通量测序技术的 快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变 体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略：方案一：对于已经比较纯合的突变体植株,可以直接对野生型植物和 突变体植株进行深度测序,通过对野生型和突变体中的变异信息的分 析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的 自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点 在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因 组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。该方法特别适合于大量突 变体的鉴定,可以同时鉴定大量的株系,且群体建立方法简便,工作 量低。X!1=T1LrFn群体I选择突变体和野生型个体JHiseq2000 platform图1 EMS突变体致变位点测序实验流程图具体的策略实施方案&方案一：选择经过连续自交的突变体纯合株系，以及其野生型纯 合体进行分别测序，测序深度在30X左右，通过生物信息学分析对 锁定遗传区域的SNP位点进行分析，获得影响基因功能的非同义突 变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测 方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个 体的DNA按等量混合，并进行低深度30X）测序，即可减少工作量 又可降低测序成本。由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合 突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析 该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步 验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的 完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资 源基础。该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作 用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。该方案一中针对具有明显表型的突变体方案包括以下三个步骤：（1）测序样本的选择及测序深度的确定选择连续多代自交的突变体植株，以及野生型植株个体，提取基 因组DNA，按照标准的lllunima建库流程，建立插入片段为350bp 的文库，根据不同作物基因组大小进行30X测序。（2）基因组重测序数据的获得与生物信息学分析通过对测序数据的质控之后，将获得的reads同野生型基因组序 列进行，找出测序数据中的SNP、InDei,对全基因组的SNP纯合度进 行分析，找出可能的突变位点，并进一步采用其他分析软件进行确认， 从而锁定出突变表型相关位点及基因。（3）突变位点的鉴定和扩大群体中验证 根据生物信息学获得突变位点信息，利用 Sanger 测序进一步在突变体中进行验证。