MTT法检测细胞存活及生长

【分享】MTT法检测细胞存活及生长什么是MTT?MTT 全称为（4,5Dimethylthiazol2yl）2,5diphenyltetrazolium bromide, 汉语化学名为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑 蓝。是一种黄颜色的染料。什么是MTT法？又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的 蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收 值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数 成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物 筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不 仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂 对实验者也有损害。MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取 MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS ）或无酚红的培养基中，用0.22“m 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4C避光保存即可。在配制和保存的过程中， 容器最好用铝箔纸包住。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细 胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度 最好在00.7 范围内。MTT 一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、 锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配， 直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不 能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套配 成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟 时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用 用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60C水浴助溶。PBS 配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HP04 1.44gKH2P04 0.24g调pH 7.4定容1LMTT法实验步骤（一）贴壁细胞1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入lOOul,铺板使待测细胞调密 度至100010000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2. 、5%CO2，37C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的 药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一 天下午铺板，次日上午加药一般5-7个梯度，每孔100ul,设3-5个复孔.建议设 5个，否则难以反应真实情况3. 、5%CO2，37C孵育1648小时，倒置显微镜下观察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT），继续培养4h。若药物 与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含 MTT 的培养液。5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。 在酶联免疫检测仪OD49Onm处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的 药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）（二）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1 X106/ml,按次序将补足的1640 （无 血清）培养基40ul ；加Actinomycin D （有毒性）10ul用培养液稀释lpg/ml, 需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）；需检测物10ul ；细胞悬液50ul （即 5X104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对 照（加100卩（储存液100 1640 ）。2、置37C，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬 浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜， 置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓 度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。MTT 法检测细胞存活和生长作者：佚名文章来源：丁香园点击数：3520更新时间：2009-9-29 8:10:36 MMTT 全称为 3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-（4, 5-二甲基 噻唑-2）-2， 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。什么是MTT法？又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶 能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二 甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反 映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活 性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵 敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也 会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5 克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS） 或无酚红的培养基中，用0.22um滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4C避光保存即可。在配制和保存的 过程中，容器最好用铝箔纸包住。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检 测结果的时候，为了保证实验结果的线性， MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT 一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存， 避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装 在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对 不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套配成的MTT需要无菌，MTT对菌 很敏感；往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯 关掉.配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60C水浴助溶。PBS 配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调 pH 7.4定容 1LMTT 法实验步骤贴壁细胞：1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边 缘孔用无菌PBS填充）。2、5%CO2, 37C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴 壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔 100ul,设3-5个复孔建议设5个，否则难以反应真实情况3、5%CO2, 37C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先 离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养 液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1x106/ml,按次序将补足的1640 （无血清）培养基40ul ； 加Actinomycin D （有毒性）10ul用培养液稀释（储存液100pg/ml,需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）； 需检测物10ul；细胞悬液50ul （即5x104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。 每板设对照（加100皿1640）。2、置37C, 5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT），继续培养4 h（悬浮细胞推荐使用WST-1, 培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min， 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养 液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。MTT 法检测细胞存活率或抑制率基本 原理 : 基 本原 理 MTT 分 析法 以活细胞代 谢物 还原剂 3-（4,5）-dimethyl thiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是 一种接受氢离子的染 料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和 细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的 formazan 结晶， formazan 结晶的生成量仅与 活细胞数目成 正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）。还 原生成的 formazan结晶可用DMSO （分析纯）来溶解。利用 酶标仪测定490 nm处的光密度OD 值， 以反映出活细胞数目。试剂配制：试剂配制： MTT 溶液： pH=7.4 的 PBS 配制成 5mg/ml 浓度的溶液， 用 避 光保存） MTT 法检测细胞存活率或抑制率详细步骤 1 接种细胞：用含 10胎/小牛血清得 培养液配成单个细胞悬液，以每孔10 -10个细胞接种到96孔板，每孔体积100-200l. 2: 培养细胞：同一般培养条件，培养1-2 天（原代细胞不 同，可根据试验目的和要求决定培 养时间，神经元 7-10 35 天，心肌细胞 8-14 天） 。3 吸去原培养基， 每孔加入以无血清培养基配制的不同浓 度药物（原代细胞例外）。 4 培养 24 或 48h 后， 每孔加 MTT 溶液（5mg/ml,pH=7.4用的PBS配制，避光保存）10-20p l.（每孔培养基为100p l，加10p l,每孔培养基为200p l,则加20p l） 。5 37C继续孵育4h，终止培养，小心 吸弃孔内培养上清 液（对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液） 。6 每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解。7比色：选择490nm波长，在酶联免疫 监测仪上测定各孔 光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐 标绘制曲线。 注 意事项： 注意事项：（1） MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就 可以。实验时一般关闭超净台上的日光灯来避光比较好。 （2）选择适当得细胞接种浓度。 （3） 避免血清干扰：一般选小于 10的胎牛血清的培养液 进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残 余培养液。（4）吸取上清时，需格外小心，切勿吸出孔底的蓝色的formazan结晶。（5） 空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对 照。其他试验步骤保持一致，最后比 色以空白调零。 广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心 （6） MTT 实验吸光度最 后要在 0-0.7 之间，超出这个范围 就不是直线关系.