生化分离技术考试题目

第一章1.1何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成);2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标；例子多种分离、纯化技术相结合，包括新、老技术的相互渗透与融合，形成所谓融合技术；生化分离技术（下游技术）与发酵工艺（上游技术）相结合或称耦合，形成系统工程； 1.2说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处材料及处理来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少目的物的提取将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关分离纯化核心操作，须据目的物的理化性质，生物性质及具体条件定浓缩，结晶，干燥保存整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）（胞内外的区别就是在于破壁）2.1简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。胞捣碎法，原理：机械运动产生剪切力 适用于动植物组织高速匀浆法，破碎程度较上法好，且机械剪切力对生物大分子的破坏较小，处理量大。原理：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然的减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。适用于：较柔软、易分散的组织细胞。研磨法和珠磨法适用于微生物与植物细胞挤压瓶 适用于细菌（G-）超声破碎物理法（反复冻融动物材料、渗透压冲击细胞壁脆弱的微生物、急冷骤热（细菌病毒等热不敏感的物质）干燥法（热空气干燥法适用于酵母，真空干燥法适用于细菌，冷冻干燥法适用于不稳定的酶）化学法，1、 溶剂处理法 丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。2、表面活性剂法添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸钠等，通过破坏细胞膜而破碎细胞，释放目的物。 此法常需与其它方法结合应用酶解法，1自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（pH、T）下保温一定时间，通过细胞本身存在的酶系的作用，将细胞破坏，使胞内物质释放。 2外加酶法 利用各种水解酶专一性地将细胞壁分解，使内含物释放出来。细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA） 酵母：采用-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。发展方向： 多种破碎方法相结合 与上游过程相结合 与下游过程相结合(如:利用金黄色葡萄球菌,发酵生产A蛋白。通常A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,然后将A蛋白从胞壁上剪切下来,过程繁琐,难度大。若用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A蛋白的分离纯化就容易得多.)2.2、简述盐析分级范围的选择依据？某纯酶和粗酶的盐析分级范围是否相同？为什么？可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得P8，回收率和纯度考虑。纯酶的分级范围比粗酶宽一些，因为纯酶的纯度比较高一些，在采用盐析时更注重回收率，可以适当加宽分级范围，而粗酶由于杂志较多则注重纯化倍数。2.3、从植物或动物材料中提取酶类，一般预处理过程中影响酶收率的原因是什么？如何解决?植物组织被破坏时，酶和酚类处混合接触状态，很易发生反应。产物苯醌和单宁酸类会继续和酶蛋白反应, 使目的酶失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。 预处理注意事项 温度尽可能低； 提取液的量要保证“充分浸入”； 加入足量酚类吸附剂；（天然清蛋白，合成聚丙乙烯） 加入足量氧化酶抑制剂； 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，又是醌的清除剂； 搅拌转速要恰当； pH要控制在合适范围，一般5.57 2.4、分离技术的主要种类：细胞破碎 (cell disruption)沉淀分离(precipitation膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography) 电泳分离(electrophoresis) 离心分离（centrifugation）1形状和大小 ： 凝胶过滤、超滤、透析电离性质 离交色谱、电泳（除SDS）极性（疏水性） 分配、吸附、疏水色谱生物功能或特殊化学基团 亲和色谱等电点pI 色谱聚焦、电聚焦溶解性 盐析、有机溶剂提取、结晶密度、大小 超离心 SDS-凝胶电泳2.5怎样选择细胞破碎的方法？总原则：最大提取、不易变性、减少干扰 具体须从材料特性和目的物特性综合考虑 。1材料细胞的特性动物细胞易破碎，只需用温和方法 植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法，微生物细胞较复杂，一般用较强方法2.目的物的特性 细胞中的位置 游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。 结合状：可能结合在膜或细胞器内 需先收集膜或细胞器，再破碎 敏感性 温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响 处理量 有些处理量大，如组织捣碎机、匀浆器等。 有些处理量少，如超声波破碎等。 3.1膜分离1、何谓“浓度极化”现象，怎样避免膜过滤中的“浓度极化”现象？浓差极化 concentration polarization ：指外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。是指在超滤过程中， 由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。 在反渗透过程中，由于水不断地透过膜，引起膜表面附近的溶液浓度升高，从而在膜的高压一侧溶液中，从膜表面到主体溶液之间形成一个浓度梯度，引起溶质从浓的部分向淡的部分扩散，这一现象即为浓差极化。 (1)增高流速首先可以采用化工上溶胀的增加骚动的措施。也就是说设法加大流体流过膜面的线速度，其中也包括采用层流薄层流道法。(2)填料法如将29-100UM的小球放入被处理的流体中，令其共同流经反渗透器以减小膜边界层的厚度而增大透过速度。小球的材质可用玻璃或甲基丙烯酸甲酯制作。此外，对管形反渗透器来说，也可向进料中微形海绵球，不过，对板式和卷式组件而言，加填料的方法是不适宜的。主要是因有将流道堵塞的危险。(3)装设油液促进器所谓湍流促进器一般是指可强化流态的多种障碍物，例如对管式组件而言，内部可安装螺旋挡板，对板式或卷式的膜组件可内衬网栅等物以促进湍流，实验表明，这些湍流促进器的效果很好。(4)脉冲法主要作法是在流程中增高一脉冲发生装置，使液流在脉冲条件下通过膜分离装置，脉冲的振幅和频率不同，其效果也不一样。对流速而言，振幅越大或频率不同，其净利要也不一样，对流速而言，振幅越大或频率越高，透过速度也越大，虽然动力增加了25-50%，但是，换来了透过速度提高了70%的得益，有相当经济价值。(5)搅拌法是目前应用广泛，特别是在测试装置中必定使用的一种方法。其主要作法是在膜面附近增高搅拌器，也可以和在磁力搅拌器上回转使用，试验表明，传质系数与搅拌器的转数成直线关系。(6)加分散阻垢剂为防止反渗透膜结垢，某厂过去曾以加硫酸或盐酸调节PH值，但因酸系统的腐蚀和泄漏使操作者很感麻烦，现在改用一种PTP-0100的高效阻垢分散剂可免去加酸的麻烦，并使系统运行正常。3.2、简述微滤膜的主要种类，特点和主要分离机理。种类 据材质分成：1）有机微滤膜， 具韧性，适应性强，制备简单，易成形，工艺较成熟。常用聚乙烯、聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烃类聚合物组成。2）无机微滤膜， 无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、耐高温、孔径分布窄、可高压反冲洗、再生能力强、分离效率高、不易老化等优点。 3）复合微滤膜 ，复合微滤膜充分利用了有机与无机微滤膜的各自优点。复合微滤膜的制备包括三种形式 1）将一层微滤膜的薄膜和常规过滤介质利用层压技术复合在一起；2）通过不同的工艺手段实现有机与无机的黏合改性；3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器(IMBR) 分离机理 (1) 筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。(2) 吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。(3) 架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。(4) 网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。(5) 静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。3.3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？不管微滤、超滤还是纳滤，选择时，一般应注意以下指标。截留分子量-指截流率达90%以上的最小被截留物质的分子量。（以球形分子测）*一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。2.流动速率- 指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。(ml/cm2.min) 。 其它还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。影响流率的因素：溶质的分子性质，比重大的纤维分子扩散性差， 比重较小的球形分子易扩散 溶质浓度：一定压力下，稀比浓流率高； 压力：不同溶质应选择不同的操作压力；搅拌：加快扩散，减少浓度极化，提高流率；*对切力敏感的大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度; 温度：升温能提高流率（不同溶质区别对待）; 其它：如溶液pH、离子强度及溶剂因素等对流率均有影响3.4、从原理上比较超滤和纳滤两种膜过滤技术，简要说明它们的主要差别。超滤：以特殊超滤膜为分离介质，以膜两侧的压差为推动力，将不同分子量物质选择性分离。 最小截留分子量500道尔顿 用途： 大分子物质的脱盐和浓缩； 小分子物质的纯化； 大分子物质的分级分离； 生化制剂或其它制剂去热原处理纳滤技术 纳滤是介于超滤与反渗透之间的膜分离技术，其截留分子量在200-1000的范围内，孔径为几纳米。截留小分子有机物同时透析出盐，集浓缩与透析一体；在保证一定膜通量的情况下，纳滤所需压力比反渗透低的多，可节约动力.3.5、超滤的工作模式有哪几种，各种工作模式的主要特点是什么。超滤的工作模式有浓缩（在浓缩悬浮粒子或大分子过程中，产物被膜系统截留在料液罐中）、透析（在悬浮粒子或者大分子透析过滤中产物被膜截留住，低分子量溶质 盐 蔗糖 醇 则通过摸）和纯化（采用这一工作模式纯化溶剂和低分子量溶质，他们被回收在透过液流中，可是在截留的物质中也可能同样含有感兴趣的产物）层析总论4.1、层析分离技术的类型主要有哪些？何谓分辨率？层析技术的分类： 据固定相基质的形式分类 可分为纸层析、薄层层析和柱层析。 据流动相的形式分类 可分为液相层析和气相层析。 据分离的原理不同分类 可分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、亲和层析等。 分辨率是相邻两个峰的分开程度，用相邻两峰的保留时间之差比上两个半峰宽之和表示。4.2、常用吸附剂的种类及特点？吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。 常用吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石等 。 1）硅胶 是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。 2）氧化铝氧化铝对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想； 用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和含有的碱性杂质，并可使颗粒表面带有阴离子，具离子交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。 3）活性炭 是使用较多的一种非极性吸附剂。一般选用颗粒活性炭，主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。 4）羟基磷灰石 HA机理的主要观点是：HA的Ca基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，对生物分子的分离起重要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则起次要作用。 4.3、羟基磷灰石分离活性物质的主要机理是什么（上面）？核酸在HA层析柱上分离的次序是单链RNA、杂链RNA、双链DNA，为什么？DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的作用。洗脱时用磷酸缓冲液，核酸分子的亲和性受其分子中磷酸集团的控制。单链rNA分子的结构可变无序，它与刚性有序的双链DNA分子相比，亲和力要小。杂交的双链DNA及部分变性的DNA分子的亲和力适中。因此单链DNA分子结合弱，结合的双链DNA分子可以通过增加磷酸洗脱缓冲液的浓度使之解离。胶过滤层析5.1、名词解释1）排阻极限 用A类分子中最小分子量表示Mwamin2）分级范围 实际是B类分子的分子量范围 3）死体积4）外水体积(V0) 间隙液体体积5）内水体积(Vi) 孔隙体积5.2、Kd的意义是什么？为什么它一般在0和1之间，大于1和小于0的反常情况可能是什么原因？怎样处理？Kd 是分配系数=固定相溶质的浓度/流动相溶质的浓度 ， A类分子只走外水体积，所以Kd=0 ;C类分子走所有的外水体积和内水体积 Kd = Ve V0/ Vi所以Kd大于0小于1. 溶质洗脱的异常 . Kd0 因装柱不好，发生沟流（短路） . Kd1 凝胶对溶质分子可能有吸附作用 5.3、请判断分子量为1千和3千的一组分子，或分子量为8万和10万一组分子能否在Sephadex G-75柱中分开？为什么？因为sephadeG-75的分离范围为10000到50000所以两组分子都在分离范围之外，不能很好的分离。5.4、伴刀豆球蛋白、血纤维蛋白、香菇多糖的分子质量能否一起用葡聚糖凝胶层析柱测定？为什么？ 凝胶过滤层析，是根据凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同的分子流动产生不同的阻滞作用，但是以上三种大分子物质的结构不同，这就会影响其在凝胶中的分配比。球状的蛋白要比血纤维的蛋白走的快，因此分离的最后效果，不仅和分子量大小有关，而且和分子的形状有关，所以不能直接用来测定三种的分子量大小。可以先将他们变性，使其有相类似的结构，然后再测定。5.5、请列出凝胶过滤层析填料主要种类，并简要说明该填料特点及应用范围。凝胶是含有大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构。总要求：: 多孔、孔隙区大，Vi 要大亲水 惰性。 稳定 色谱性能好 填料有以下几种：1.交联葡聚糖（sephadex）：骨架为葡聚糖（dextran）主键为-1,6糖苷键 （约95%）分支：-1,3糖苷键（约5%）交联剂：环氧氯丙烷以醚键交联 ，特点：化学稳定性较好PH范围为212，在强酸下凝聚糖苷键易水解，在强碱下，羟基易氧化成酸。热稳定性较好，可以高压灭菌。使用范围：总的工作范围为分子量10060万。有一定的离子吸附性（离子性、芳香性）。2、聚丙烯酰胺（bio-gelp-x）丙烯酰胺用N,N 甲叉双丙烯酰胺铰链而成，其中x为2300，x=工作范围/1000.特点：稳定ph范围211，物理稳定性和sephadex相同，总工作范围为10040万。吸附性：I0.02 3、交联丙烯基葡聚糖（Sephacryl）N,N 甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基右旋糖苷 形成的凝胶，较硬，强度大，特点：稳定ph范围：211较Sephadex 抗压 色谱性能 作范围：10007亿 吸附性： I 0.05 4、琼脂糖凝胶（Sepharose）-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖糖浓度越大，网孔越小型号：Sepharose 2B、4B表示糖浓2% Bio-Gel A 0.5150M 表示工作范围上限 特点：稳定的ph范围4.59.0，抗热性差，抗压性好，总工作范围：1034107 吸附性： 需I0.02 5、.结构： 强碱条件下用2,3二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联.稳定性 化性： pH 314 物性：抗热、抗压均提高.色谱性能 1.工作范围： 同Sepharose 吸附性： 下降 6、superose 一种具高分辨率，高机械强度，很宽分级范围的新型凝胶过滤介质，是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的，适合于组分分子量差异较大的混合物的分离。Superose具体特点：. 机械和物理稳定性很好，适合于高速分离过程，即使用高粘度的洗脱剂如8mol/L尿素仍能保持较高的流速，在pH7，121反复高压灭菌不会对凝胶结构产生明显影响;.化学稳定性也很好，能够耐受0.2mol/L的NaOH，0.01mol/L的盐酸，1mol/L的醋酸，去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍等。 7、 Superdex颗粒很小且均匀，柱效非常高，很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；物理稳定性良好，pH7条件下能承受高压灭菌； pH稳定性良好，清洗时（短程）可暴露在极端pH（114）下而不会对层析行为产生影响；凝胶的分离行为不受去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍的影响。该介质同样能在有机溶剂中使用。 5.6、请按凝胶层析流程顺序分析说明主要操作要点。实验设计的总的要求：高分辨率、回收率高、减少稀释、短时间、最好保证样品为组别分离，已知目的物的Mw ：原则：选斜率大即 Kd大，效果好； 选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。 未知目的物的Mw 先用中等工作范围的，再据结果进行选择。样品的浓度70mg/ml ；离子强度；综合考虑种种因素：分级分离时，Vs一般选13% Vt； 组别分离时，Vs可选30%最好1520% Vt ；据样品量确定 分级分离： Vt = 30100 Vs 组别分离： Vt = 36 Vs；H/D分级分离：H/D可选择在30100 ； 组别分离：H/D 相对可低些。H/D 小，抗流变性差，区带易发生崎变，但流速大； H/D 大，抗流变性好，区带不易发生崎变但流速小。洗脱剂 据凝胶溶质的要求来选择 洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化；吸附较强的，调节pH和离子强度；需冷冻干燥的，选挥发性盐类； 对脱盐操作，可选用蒸馏水；流速 流速过大，动定相不平衡 流速过小，纵向扩散增加 Gel的选择和准备1. 凝胶溶涨 一般湿胶洗脱剂（v/v）=31的比例添加洗脱剂，搅匀后即可装柱 ；干胶用量（g）r2h / 膨胀度（床体积mL/g干胶）倾析 用此法除去上部过细部分（破损凝胶） 稠度 一般控制沉积体积为总体积7075% 脱气 仪器的准备装柱：要求：均匀、无裂缝、无气泡、床面平整 一般步骤： 安柱 充填 平衡 检验*对软胶，装前须先校对操作压力！加样：要求： 不能干扰Gel沉淀表面 方法：排干法、直接法、加样器法 洗脱 速控制 收集、检测 紫外连续检测 清洗 一般用洗脱液继续平衡即可 若被脂肪污染，可用0.10.5mol/LNaOH（除Sepharose）或非离子表面活性剂清洗。 贮藏 须加化学试剂防腐，0.020.05%的叠氮钠离子交换层析6.1、层析系统的分辨率主要取决于什么参数，何种最重要？层析系统的分辨率主要取决于：选择性，效率n，和 k容量因子三个参数。选择性较为重要。容量因子k又称保留因子，是层析分离中常用的组分保留值表示法，注意不要将其与离子交换剂的吸附容量（mg样品/ml胶）相混淆。一般来说，容量因子k的取值与蛋白质在固定相（离子交换剂）和流动相（缓冲液）中的分配性质、层析温度及固定相和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。提高RS以达满意分离效果，须满足以下条件： （1）1（当VR1VR2时1，两峰完全重叠，分辨率为0），的值越大，两峰相距越远，分辨率越高；（2）N尽可能大，理论塔板数越大，柱效率越高，分辨率也越高； （3）k0，若k0，无法实现分离，分辨率为0，需选合适层析条件，使至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满足k 0，增加k的值将提高分辨率RS，有利于分离。 6.2、装填制备合格的层析柱主要应注意那几点？如何检验？如何保养？.柱尺寸（H/D）;连续梯度：H/D 45；阶段式梯度：H/D12；.充填；.平衡：23Vt始缓平衡，测定电导、pH是否平衡完毕：目的：.床体积稳定.流出液pH、I一致 样品 ； 测完后清洗6.3、离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？ 离子交换剂是离子交换技术的核心和基础： 基质+功能基团+平衡离子 离子交换时平衡离子发生交换 为阴离子，是阴离子交换剂 ；为阳离子，是阳离子交换剂 6.4、弱酸性和弱碱性的离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内使用？为什么？强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽；弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小；弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱；弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。流动相的酸度：离子交换树脂就是固体酸碱，对于强型而言pH影响不大，弱型则显著。强酸型阳离子，pH2；弱酸型阳离子，pH6；强碱型阴离子，pH12；弱碱型阴离子， pH76.5、已知目标蛋白是分子量约200,000，等电点为6.8，pH稳定范围在4.07.5的酶分子，如何选择离子交换剂并设定层析条件？10万-20万 用Sepharose或交联纤维素，弱阳离子交换剂CM(pH3.5-6)，流动相的ph5,流速 1cm/min6.6、在对某样品进行离子交换层析分离后得到如下层析图谱，层析采用了NaCl浓度梯度洗脱，NaCl终浓度为1mol/L，如何根据此层析结果优化层析条件？（*号标记的是目标蛋白）亲和层析7.1、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。（1）.上样 亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常10cm左右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、 pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。（2）.洗脱：亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。（1）特异性洗脱 特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。（2）非特异性洗脱非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。当待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。当待分离物质和配体结合较强时，可以通过选择适当的pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力，具体的条件需要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度一次快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。但选择洗脱液的pH、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质丧失活性。对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。7.2、亲和层析吸附剂制备时，为何常引入“手臂”？在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）；疏水性手臂具体选择应考虑： 分离物质分子量大小 亲和势大小 过长手臂易弯曲、折叠等；最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3-二氨基二丙胺。 7.3、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。一、要求 . L与基质结合，对L-S结合无干扰； .L为小分子有的需“手臂”，使L-S结 合更有效； . 非专一吸附不大，以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。二、 偶联用Gel的选择 需考虑： . L上可供偶联的基团. “手臂” . L的稳定pH 三、由CNBr活化型Sep.4B制备 商品名：CNBr-Sepharose . 溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子 . 偶联条件 注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH . 掩蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（45次） 7.4、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围一、共价色谱:利用形成和破坏共价键能力的差异分离,其共价键常为二硫键S-S,主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽。二、金属螯合色谱原理：His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。原理：蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物 四、有机染料亲和色谱：有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力五 凝集素亲和层析：凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合；不同的凝集素结合不同的糖分子用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等反相层析8.1、简要说明反相层析的原理，并解释何谓疏溶剂理论（solvophobic theory）。基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏水性配基间的疏水相互作用 。反向层析可用疏溶剂理论来解释。疏溶剂理论假设反相层析介质是表面均匀密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固定相之间不存在其他任何相互作用。 8.2、何谓“亲硅醇基效应”（silanophilic interaction）？ 如何解决其对反相层析的影响？一定条件下，硅胶表面残余的硅醇基能与溶质发生相互作用而对溶质的保留行为起决定作用 ;亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性较差，洗脱峰脱尾等不良层析行为 ;硅胶表面均匀覆盖非极性配基，对残余硅醇基屏蔽，可基本排除亲硅醇基效应的影响。新型反相层析介质聚苯乙烯等高分子聚合材料的开发，可根本消除亲硅醇基效应的影响。8.3、试分析和说明反相层析过程中主要可优化的条件。反向层析的优化层析过程中PH值的控制，因为流动相pH的改变影响到溶质的解离状态、固定相表面残留硅醇基和其他吸附基团的解离情况、以及添加至流动相的可解离组分的离子平衡 。反相层析多数在低pH条件下运行，流动相的pH通过添加一定浓度的酸来调节；离子强度的控制：离子对试剂中很多本身就是酸或碱（p143)，可同时起维持流动相pH的作用。离子对试剂典型的使用浓度范围是 0.01%0.1%或10100mmol/L。往流动相中添加离子对试剂可以改变溶质的保留值和选择性，获得较好的分离效果；对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子对试剂，如三氟乙酸等，对于带负电荷的溶质则应选用带正电荷的离子对试剂，如季铵盐等。 层析介质由多孔基质颗粒键合疏水性的配基组成，因具较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效；（硅胶有高ph值下不稳定的缺点）反相层析领域使用时间最长，应用最广泛的基质是硅胶 开发新的更有效的介质。考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率的要求、流动相条件：待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导；样品组分的疏水性质决定采用何种配基；分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ；反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基质的选择。 层析柱的尺寸由内径和柱长所界定，其取值主要取决于分离的规模和所需的分辨率，其中内径的取值与分离规模相关，而柱长和分辨率之间则存在一定的联系反相层析介质都属于高效层析介质，粒径很小，对填充技术的要求很高 ，人们可据所选择的介质种类和层析柱尺寸直接选择对映的反相层析预装柱，预装柱平衡后可直接使用；层析柱的平衡 ，一般用流动相A对层析柱进行充分的平衡。乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异丙醇等；溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用溶剂中的稳定性是须考虑的因素；分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相； 样品的处理理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如样品在流动相A中溶解不好，可考虑添加有机酸、盐类等试剂来增加样品的溶解性；样品在加样前应当通过10000g离心10min或用0.22m微孔滤膜过滤除去任何可能存在的颗粒物；反相层析柱通常是预装柱或带有可调接头的自装柱，连接于HPLC系统，加样操作按HPLC系统提供的标准进行。 洗脱模式的选择和条件控制在洗脱模式方面，反相层析和离子交换等层析技术具相似性，分为阶段洗脱和梯度洗脱；样品的检测和收集和其他层析技术一样，反相层析中最常用的也是紫外检测（很多情况下，有机溶剂或添加剂等的存在总会对样品的检测产生一定的影响 ）对于能产生荧光的物质，使用荧光监测器往往比紫外检测有更高的选择性和灵敏度。此外，视差折光检测器、电导检测器等也都能用于层析样品的在线检测。层析柱的再生、清洗和贮存再生常用25个柱体积的流动相B流经层析柱移去残留在层析柱上的物质；清洗常运行线性梯度从0.1%TFA到0.1%TFA异丙醇，再几个柱体积的0.1%TFA异丙醇溶液，最后运行线性梯度从0.1%TFA异丙醇溶液重新回到0.1%TFA水溶液；基于硅胶的介质常保存在纯的甲醇中，基于聚苯乙烯的介质常保存在甲醇或20%乙醇中 8.4、试解释线性梯度洗脱的反相层析中溶质得到浓缩的机理在洗脱模式方面，反相层析和离子交换等层析技术具相似性，分为阶段洗脱和梯度洗脱；梯度洗脱是采用修饰剂体积分数连续变化的流动相对吸附样品进行洗脱。梯度的形状主要分为线性梯度和非线性梯度，其中线性梯度又可分为连续线性梯度和分段线性梯度。 疏水层析9.1疏水作用层析的固定相和流动相与普通吸附层析有何区别？为什么？介质：在HPLC中，应选机械强度较大的刚性基质；若待分离物质分子量很大，且样品量较大，则应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待分离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4C8之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生-相互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。样品的准备：往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与流动相A中基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件 HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样 流动相A与流动相B流动相A的缓冲液的种类、pH ，盐的种类和浓度的选择： 缓冲液种类据所需的pH选择，注意目标物的稳定性，浓度一般在0.010.05mol/L； 不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随目标分子的疏水性而异，(NH4)2SO4常用0.752mol/L，NaCl为14mol/L 流动相B为不含盐的缓冲液，缓冲液与流动相A一致9.2、请从原理、填料、应用范围几方面比较反相层析与疏水层析的主要差异。 原理： 疏水层析的原理是，高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。 反响层析：基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏水性配基间的疏水相互作用 ，疏溶剂理论假设反相层析介质是表面均匀密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固定相之间不存在其他任何相互作用。填料：HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与反相层析介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基，而且反向层析介质上的取代程度大于疏水介质中的。应用范围：正应为上述特点，反向色谱由于其结合力较强，适合在水-有机溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分子蛋白质的分离纯化；HIC过程洗脱条件温和，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白质的纯化中有较广泛的应用。 电泳10.1、简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的主要方法和特点并说明影响聚合的主要因素。所用原料：丙烯酰胺Acr,双丙烯酰胺Bis1.化学聚合法：催化剂，过硫酸铵（AP）加速剂，NNNN-四甲基乙二胺（TEMED） 影响聚合的因素：.O2会淬灭自由基，所以需脱气； .加速剂叔胺处在自由碱基状态，需高pH; .温度t t 慢 t 快 .避免不纯物的影响：有机玻璃、赤血盐（铁氰化钾）等会造成无法聚合。2 .光聚合法，VB2 光解 无色基 02 自由基 引发聚合 常采用来制备大孔胶10.2、等电聚焦IEF的主要原理是什么？为什么等电聚焦过程一般都采用高电压、恒功率方式？ 原理：在一种特殊的两性电解质两端施加直流电场，可形成线性的pH梯度。利用Pr的pI差别，可在其上不同处聚焦分离。聚焦在pH0.01范围， 所以分辨率很高。 特点：高电压，地电流，冷却原因：等电聚焦电泳中，通常采用恒功率方式。 随样品迁移。电流会越来越小，功率是电压和电流的乘积，所以为加快分离，提高分辨率, 电压应是越高越好，但须避免烧胶（受胶的厚薄、电泳的冷却系统、载体两性电解质的导电性和pH、凝胶介质及样品的质量、加速剂的用量等因素影响）。恒功率，在最后有个安全区。10.3、请比较Native PAGE 与SDS-PAGE在原理和应用上的主要差别 。一、常规的PAGE电泳，原理：根据分离物质的电荷密度，电荷种类，分子大小，分子的形状不同在电场中迁移的速率不同而得到分离。应用其特点是天然高分子化合物的分离，而保持其活性。缓冲液系统： pH决定 生物分子溶解性、稳定性、 电泳时间、分辨率 酸性蛋白质阳极电泳（pH8.09.5 ） 碱性蛋白质阴极电泳（pH4.0左右 ）三种不连续系统：高pH系统（9.5、8.9） “中性”pH系统（8.0） 低pH系统（5.5、4.8、3.6）凝胶浓度的选择样品分子量未知，一般可先选7.5%的均匀胶，理想的Rf范围在0.250.85之间；也可根据凝胶浓度与分子量的关系来选择：测定蛋白质分子量：天然PAGE测定蛋白质的分子量需排除电荷的影响，因此需测量蛋白质分子在不同浓度凝胶中的相对迁移率从而得到蛋白质的分子量。具体方法： 先用不同浓度的凝胶同时测量未知和已知分子量的蛋白质的相对迁移率；对不同蛋白质分子，以其相对迁移率的对数对凝胶浓度作图，直线的斜率为阻滞系数；用已知分子量的蛋白质的阻滞系数对它们的分子量作图，得到一条直线，在此直线上根据未知蛋白质的阻滞系数可查得它的分子量。 二、SDS-聚丙烯酰胺Gel电泳 十二烷基硫酸钠 CH3(CH2)11OSO3Na原理：样品中加入：1. 含-S-S-的还原剂，打开Pr分子二硫键2.SDS破坏Pr分子的氢键和疏水键，并与之形成Pr-SDS复合物结果导致：.复合物带大量负电，不同Pr电荷密度相同.球状 Pr 变成雪茄状，长轴MW（3）泳迁移率仅与MW（长轴）有关。注意：1. SDS的加量：一般10gSDS/gPr 2. Gel浓度 3.多亚基的Pr SDS凝胶分离高分子化合物后失活，需要进行生物活性的修复从蛋白中去除SDS，许多蛋白可恢复活性或局部恢复活性，其影响因素为：SDS纯度；蛋白酶；二硫键；其它：去除速度、辅因子、DTT等（胶中进行，局限于单肽链或亚基相同）SDS凝胶分为，连续电泳，和不连续电泳均匀胶，不连续电泳梯度胶。10.4、归纳凝胶电泳技术中检测条带的主要染色方法和特点，分析条带变形的主要原因。 一、(1)考马斯亮蓝染色 分为R-250和G-250，常用R-250染色后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系，在一定pH值时，蛋白质-染料复合物又可解聚 染色灵敏度达0.20.5mg/带(2)银染色 先固定，蛋白带上的AgNO3被还原成金属Ag而沉积在蛋白带上而显色，显色有化学显色和光显色 ，敏度达2ng/带 (3)其他染色方法 荧光染料法、苯胺黑、氨基黑、丽春红S、快绿FCF，蛋白质与2,4-DNFB的反应 等等二、条带在试验操作不当时会出现异常现象，“微笑”现象常在厚胶和垂直电泳中出现，原因：凝胶中间冷却不均匀；“皱眉”原因 （垂直电泳中可能出现） 电泳装置不合适，靠近隔板处凝胶未聚合完全或凝胶底部有气泡。原因：样品溶解不佳，凝胶浓度过高。克服：加样前离心，选合适缓冲液，加增溶辅助试剂，降低凝胶浓度“纹理”现象原因：常常是样品中不溶颗粒造成的克服：增加溶解度，离心除不溶颗粒10.5、常用测定蛋白质分子量的方法有哪些？（手写板第页）sds-page 用于测定蛋白质分子量。特点：所测得的是变性蛋白的分子量或接力亚基的分子量。天然PAGE:用于蛋白质分子量的测定，特点：测得的是天然蛋白质的分子量，但需要较多步骤。凝胶过滤色谱：有效分配系数Kav或Ve与溶质相对分子量的对数之间存在线性关系。特点：分离天然非变性的蛋白质分子分子量，且不受带点和量的影响。超速离心在离心力场中，沉降系数，扩散系数，与分子量有一定的对应关系。通过测定某种颗粒的沉降系数后可以计算出他的分子量。特点：无需做标准曲线但需要测定溶质的扩散系数。