分子医学技能：免疫印迹

Immunoblottingl印迹技术印迹技术是将生物大分子物质（核酸或蛋白质）通过不同的途径转移到固相载体上，然后与相应的探针发生化学或免疫学反应，显示谱带的一种方法。l分类：分类：nSouthern Blot: 分析DNAnNorthern Blot: 分析RNAnWestern Blot:分析蛋白质, 是将凝胶电泳与固相免疫相结合的一种复合免疫技术,又称免疫印迹。l通过SDS-PAGE将抗原按其分子量大小分离；l转移到固相支持载体（硝酸纤维膜）上；l封闭空白位点；l再与抗体共孵育后，特异性抗体与抗原结合形成免疫复合物；l用酶标抗体作为示踪二抗；l加入能形成不溶性显色物的酶底物，使目的条带显色，对抗原进行鉴定。电极电极膜膜胶胶滤纸滤纸转移槽转移槽 优优 点：点：n同时具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性；n方法简便；n标本可长期保存；n结果便于比较。u蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （已完成）u蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝纤膜 （已完成）u封闭硝纤膜的免疫球蛋白结合位点 （操作内容）u酶标抗体结合与染色 （操作内容）lNC膜 1条/组l5脱脂奶粉 1ml/组l一抗溶液 1ml/组l酶标抗体 1ml/组lPBS 10ml/组l小镊子 1支/组l底物显色液 10ml/班1.封闭：把NC膜（已转印）放入小试管中，加入5脱脂奶粉1ml，塞上小胶塞，室温下温育20分钟，期间注意缓慢摇动数次。2.打开胶塞，弃去封闭液，立即加入一抗溶液与滤膜一同温育30分钟。3.弃去液体，加PBS（2-3 ml）漂洗2次，每次2-3分钟。4.加入1ml酶标二抗，3730分钟，不时摇动。5.弃去液体，加入PBS（2-3ml）漂洗3次以上，每次3分钟。6.加入底物DAB覆盖NC膜，避光显色5-10分钟。7.分析结果。