标记PPT学习课件

2022-6-30海南大学农学院wss1概念概念 标记：标记：以共价键的方式将某些元素或化学以共价键的方式将某些元素或化学基团（标记物）结合到生物分子中，成为基团（标记物）结合到生物分子中，成为示踪复合物（探针），通过一定的方法显示踪复合物（探针），通过一定的方法显示其存在的部位。示其存在的部位。 探针：探针：带有标记物的、感兴趣的生物大分子带有标记物的、感兴趣的生物大分子或小分子，当它们与相应的物质反应时（杂或小分子，当它们与相应的物质反应时（杂交），筛选得到确定的信息资料。交），筛选得到确定的信息资料。 标记物：标记物：放射性同位素、化学发光物、生放射性同位素、化学发光物、生色基团、荧光物等。色基团、荧光物等。第1页/共76页第一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss2内容提要内容提要第一节第一节 核酸标记核酸标记第二节第二节 蛋白质（酶、抗体）蛋白质（酶、抗体）标记标记第2页/共76页第二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss3第一节第一节 核酸标记（制备探针核酸标记（制备探针）核酸探针核酸探针（probeprobe）：能与特定核酸序列能与特定核酸序列（靶序列）发生特异性互补（核酸）（靶序列）发生特异性互补（核酸）杂交，并含示踪物的已知核酸片段杂交，并含示踪物的已知核酸片段( (DNADNA或或RNA)RNA)。因而可检测样品中特因而可检测样品中特定的基因序列。定的基因序列。第3页/共76页第三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss4 根据核酸探针的来源及性质有根据核酸探针的来源及性质有双链双链DNADNA、单链、单链DNADNA、单链、单链RNARNA和人工合成的寡和人工合成的寡核苷酸探针核苷酸探针等。用于分子杂交的核酸探针均须进行标记，带有示踪物，与靶基因等。用于分子杂交的核酸探针均须进行标记，带有示踪物，与靶基因杂交后，才能检测显示出杂交体信号。杂交后，才能检测显示出杂交体信号。 标记物有标记物有放射性同位素放射性同位素和和非放射性同位素非放射性同位素两大类。两大类。3 3H H、3535S S和和3232P P是三种较常是三种较常用的放射性同位素标记物，非放射性同位素标记物较常用的是用的放射性同位素标记物，非放射性同位素标记物较常用的是生物素（生物素（biotinbiotin）、地高辛（地高辛（digoxigenindigoxigenin，DIGDIG）和和荧光素荧光素等。等。第4页/共76页第四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss5探针所携带的标记物应具备的条件：探针所携带的标记物应具备的条件：1.1.标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。2.2.标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。3.3.稳定性好、环境污染少、价廉。稳定性好、环境污染少、价廉。第5页/共76页第五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss6一、标记物的制备及类型一、标记物的制备及类型 以标记物分类：以标记物分类：放射性同位素标记（放射性同位素标记（3 3H,H,1414C,C,3232P,P,3535S,S,125125I I）非放射性同位素标记（地高辛、生物素、酶、荧光非放射性同位素标记（地高辛、生物素、酶、荧光素）素） 以制备方法分类：以制备方法分类：双链双链DNADNA探针标记法；探针标记法；单链单链DNADNA探针标记法；探针标记法；PCRPCR合成合成DNADNA探针；探针；寡聚核苷酸探针；寡聚核苷酸探针；RNARNA探针。探针。第6页/共76页第六页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss7标记方法标记方法掺入法掺入法: :即在即在DNADNA、RNARNA合成时，标记物携带在单核苷酸上，作为合成的原合成时，标记物携带在单核苷酸上，作为合成的原料形式直接掺入进去。料形式直接掺入进去。方法分类：方法分类： 1. 1.随机引物法随机引物法 2. 2.切口平移法切口平移法 3.cDNA 3.cDNA合成法合成法 4. 4.PCRPCR法法 5.3 5.3，5 5末端寡聚核苷酸末端寡聚核苷酸 6 6.3.3加加poly(A)poly(A)尾等方法。尾等方法。第7页/共76页第七页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss8第8页/共76页第八页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss9二二 、非核素标记、非核素标记 非放射性核素标记都很容易掺入到非放射性核素标记都很容易掺入到DNADNA或或RNARNA中制成核酸探针。中制成核酸探针。 使用的非放射性物质主要是使用的非放射性物质主要是生物素、地高辛、荧光素生物素、地高辛、荧光素。 检测方法主要有三种：检测方法主要有三种：化学发光法、生色法、荧光法。化学发光法、生色法、荧光法。第9页/共76页第九页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss101. 1. 地高辛地高辛（ digoxigenin DIGdigoxigenin DIG）是一种类固醇是一种类固醇物质，来源于洋地黄类植物物质，来源于洋地黄类植物。第10页/共76页第十页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss11 DIGDIG标记标记是德国是德国Boehringer MannheimBoehringer Mannheim公司发展的一种非放射性标记方法。公司发展的一种非放射性标记方法。Digoxigenin-11dUTPDigoxigenin-11dUTP可以通过随机引物标记结合到可以通过随机引物标记结合到DNADNA探针或通过探针或通过DNADNA体体外转录标记到外转录标记到RNARNA探针，或通过探针，或通过3-3-尾端标记结合到寡聚核苷酸探针。然后尾端标记结合到寡聚核苷酸探针。然后与抗地高辛抗体（与抗地高辛抗体（anti-digoxigenin alkaline phosphataseanti-digoxigenin alkaline phosphatase）进行免疫反应，通）进行免疫反应，通过化学呈色检测。过化学呈色检测。第11页/共76页第十一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss12技术特点：技术特点：与放射性标记相比较，与放射性标记相比较，DIG DIG 系统具有以下多个优势：系统具有以下多个优势： 高灵敏度高灵敏度 曝光时间短曝光时间短 安全环保安全环保 探针可重复使用探针可重复使用 可轻松进行探针拨离和重探可轻松进行探针拨离和重探第12页/共76页第十二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss132. 2. 生物素生物素将生物素（将生物素（BiotinBiotin）连接在核酸探针上，利用）连接在核酸探针上，利用亲和亲和素对生物素有极高亲和力素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和的原理，分子杂交后用亲和素（素（AvidinAvidin）或链霉亲和素（）或链霉亲和素（StreptavidinStreptavidin）进行检测。）进行检测。酶酶一底物颜色反应检测：一底物颜色反应检测：亲和素可以用酶（过氧化物酶、亲和素可以用酶（过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、荧光素或高电子密度（铁蛋白、胶碱性磷酸酶等）、荧光素或高电子密度（铁蛋白、胶体金等）的标志物标记。生物素标记探针稳定，不失体金等）的标志物标记。生物素标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简单方便。活，并能配用多种检测系统，简单方便。 第13页/共76页第十三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss14第14页/共76页第十四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss153.3.分子信标（分子灯塔探针）分子信标（分子灯塔探针）第15页/共76页第十五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss16三、核素标记三、核素标记 （一）核酸探针传统的标记物是用放射性同位素，多用（一）核酸探针传统的标记物是用放射性同位素，多用3232P dNTPP dNTP、3 3H dNTP H dNTP 、3535S S dNTPdNTP等。用放射性同位素标记核酸有以下优点：等。用放射性同位素标记核酸有以下优点： 1.1.灵敏性高灵敏性高 2.2.特异性高特异性高 3.3.方法简便方法简便第16页/共76页第十六页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss17（二）放射性同位素标记技术也存在以（二）放射性同位素标记技术也存在以下缺点：下缺点： 1.1.半衰期短，必须经常标记探针半衰期短，必须经常标记探针2.2.费用高费用高3.3.检测时间长检测时间长 4.4.放射性同位素对人体有害放射性同位素对人体有害第17页/共76页第十七页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss181.1.3232P P2.2.3333P P比比3232P P使用安全。使用安全。3.3.含含3535S S的前体标记物的前体标记物NTPNTP或或dNTPdNTP是借助以取代与磷酸共价相连的氧原子制成的。是借助以取代与磷酸共价相连的氧原子制成的。4.4.3 3H H标记的探针常用于原位杂交和核酸的合成和降解分析，与标记的探针常用于原位杂交和核酸的合成和降解分析，与3232P P、3535S S、125125I I等比等比较，它的能量最低。较，它的能量最低。（三）几种常用放射性同位素比较（三）几种常用放射性同位素比较第18页/共76页第十八页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss19常用放射性核素的物理性质常用放射性核素的物理性质核素核素 半衰期半衰期100%100%纯度时核素纯度时核素放射性活性放射性活性( (Specific activitySpecific activity) ) (Ci/mmol)(Ci/mmol)放射粒子的最大能量放射粒子的最大能量Emax(KeV) 3H 12.4年 29 18.5 14C 5100年 62 156 32P 14.3天 9120 1710 35S 87.1天 1490 169 125I 60天 2400 34.6 34.5131I 8.6天 16100 608 365第19页/共76页第十九页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss20 1.1.3232P P标记在标记在NTPNTP或或dNTPdNTP的的 磷酸位上。磷酸位上。用放射自用放射自显影或磷酸图像仪检测。显影或磷酸图像仪检测。Nucleotide labelingNucleotide labeling第20页/共76页第二十页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss213232P or P or 3333P P 可取代可取代dNTPdNTP或或NTPNTP不同磷酸位上的不同磷酸位上的P P原子原子 ，3535S S可取代核酸中磷可取代核酸中磷酸分子上的一个酸分子上的一个O O原子，原子，3 3H H取代取代H H原子。原子。O O O P ?dCMP第21页/共76页第二十一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss22PdCMPSdCMPHO O O P ?O O O P ?第22页/共76页第二十二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss23四、常用的探针标记法四、常用的探针标记法1.1.双链双链DNADNA探针标记探针标记（1 1）随机引物介导法）随机引物介导法（2 2）切口平移法）切口平移法2.2.单链单链DNADNA探针制备探针制备3.PCR3.PCR合成合成DNADNA探针探针4.4.寡核苷酸探针的制备寡核苷酸探针的制备5.RNA5.RNA探针的制备探针的制备第23页/共76页第二十三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss241.1.双链双链DNADNA探针标记探针标记（1 1）随机引物介导法）随机引物介导法 随机引物是随机引物是6 61212个核苷酸单链（来源于某种生物组织细胞的个核苷酸单链（来源于某种生物组织细胞的DNADNA降解小片段或降解小片段或人工合成的）。人工合成的）。 随机引物与线性随机引物与线性DNADNA模板杂交，在模板杂交，在DNADNA聚合酶的催化下，从引物的聚合酶的催化下，从引物的33末端开始按末端开始按5353方向合成与模板方向合成与模板DNADNA互补的互补的DNADNA链，如有链，如有-3232PdNTPPdNTP或其他标记物的或其他标记物的掺入，就可产生标记的掺入，就可产生标记的DNADNA探针。探针。见见P182P182图图第24页/共76页第二十四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss25 变性变性DNADNA 加入随机引物混合物加入随机引物混合物 ( (六核苷酸六核苷酸) )和和dNTPdNTP标记混合物标记混合物 加入加入Klenow Klenow 片断片断 ( (无核酸外切酶活无核酸外切酶活性性) )第25页/共76页第二十五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss26Labellingprobesby“randompriming”DNA DNA 片断片断热变性热变性5533加入随机引物加入随机引物六核苷酸所有随机组合有六核苷酸所有随机组合有40964096种种第26页/共76页第二十六页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss2753533355加入加入 DNADNA聚合酶聚合酶dNTPs dNTPs 其中一个是标记的其中一个是标记的 dNTPdNTP第27页/共76页第二十七页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss28 3232P dATP P dATP 通常用作放射性标记的探针。通常用作放射性标记的探针。放射自显影检测。放射自显影检测。地高辛地高辛(DIG)-dUTP(DIG)-dUTP通常用作非放射性标记的探针。用酶联抗地通常用作非放射性标记的探针。用酶联抗地高辛抗体检测。高辛抗体检测。变性变性第28页/共76页第二十八页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss29 3232P dATPP dATP通常用作放射性标记的探针。通常用作放射性标记的探针。放射自显影检测放射自显影检测 -particlesblackenX-rayfilmDNADNA固定在杂交膜上固定在杂交膜上第29页/共76页第二十九页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss30第30页/共76页第三十页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss31（2 2）切口平移法（）切口平移法（Nick TranslationNick Translation） 原理及过程：原理及过程： 当双链当双链DNADNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I可把核苷酸残基加到切口处的可把核苷酸残基加到切口处的3 3 羟基端。羟基端。由于该酶具有由于该酶具有5 5 3 3外切核酸酶活性，所以它可外切核酸酶活性，所以它可从切口的从切口的5 5端除去核苷酸。端除去核苷酸。5 5端除去与端除去与3 3端加入核端加入核苷酸同时进行，导致切口沿着苷酸同时进行，导致切口沿着DNADNA模板链移动。模板链移动。随着反应的进行，底物中被标记的单核苷酸被随随着反应的进行，底物中被标记的单核苷酸被随机掺入。机掺入。DNADNA聚合酶聚合酶I I的两种作用交替进行，探针的两种作用交替进行，探针即被标记。即被标记。 第31页/共76页第三十一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss32切切口口转转移移第32页/共76页第三十二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss33第33页/共76页第三十三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss342.2.单链单链DNADNA探针制备探针制备用用DNADNA模板制备单链模板制备单链DNADNA探针的方法有：探针的方法有：（1 1）合成可克隆于噬菌粒或）合成可克隆于噬菌粒或M13M13噬菌体载体上的噬菌体载体上的DNADNA为模板，合成与其序列互补的为模板，合成与其序列互补的探针；需要分离探针与未标记的核酸。探针；需要分离探针与未标记的核酸。（2 2）将克隆于特定载体上靶序列转录成）将克隆于特定载体上靶序列转录成RNARNA的探针。用不含有的探针。用不含有RNARNA酶的酶的DNADNA酶酶极极易除去模板易除去模板DNADNA。第34页/共76页第三十四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss35第35页/共76页第三十五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss363.PCR3.PCR合成合成DNADNA探针探针 在在PCRPCR循环过程，循环过程，Tag DNATag DNA聚合酶可将聚合酶可将标记的标记的dNTPdNTP掺入掺入DNADNA链中，用此法制备的链中，用此法制备的探针灵敏度高，数量大。探针灵敏度高，数量大。第36页/共76页第三十六页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss37PCRPCR合成合成DNADNA探针探针 Labeling in a polymerase chain reactionLabeling in a polymerase chain reaction 在在PCRPCR反应里有用反应里有用DIG- DIG- 或或 3232P-P-标记了的标记了的 dNTP : dNTP : 第37页/共76页第三十七页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss384.4.寡核苷酸探针的制备寡核苷酸探针的制备1 1）3 3端寡核苷酸探针端寡核苷酸探针2 2）3 3端尾部寡核苷酸探针端尾部寡核苷酸探针3 3）5 5端寡核苷酸探针端寡核苷酸探针第38页/共76页第三十八页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss39(a) 5-pNpNpNpNpN-OH-3DNAorRNAddA-p*-p-p-末端转移酶末端转移酶+ +- -3232P-ddATPP-ddATP5-pNpNpNpNpNp(a)NpA-pApAH-33 3 - -末端标记（末端标记（3 3 - - end labellingend labelling）(a) (a) 单链单链 (DNA or RNA) (DNA or RNA) 标记用末端转移酶标记用末端转移酶第39页/共76页第三十九页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss40第40页/共76页第四十页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss413 3 - -末端标记末端标记 (b) (b) 双链双链 DNA DNA 用用 DNA DNA 聚合酶聚合酶第41页/共76页第四十一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss425-NGGATCC.N-3DNA3-NCCTAGG.N-5dA-p*-p-p -DNA DNA 聚合酶聚合酶+ -32P-dATP+dCTP,dGTP,dTTP5-NG-35-GATCC.N-33-NCCTAG-53-G.N-55-NGGATCGATCC.N-33-NCCTAGCTAGG.N-5用用BamBamHI HI 限制性内切酶消化限制性内切酶消化REDNA DNA 片断片断 3 3 - -末端被标记末端被标记第42页/共76页第四十二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss43第43页/共76页第四十三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss445 5 - -末端标记（末端标记（5 5 - - end labellingend labelling） 是一个两步反应是一个两步反应; ; 适用于适用于RNARNA和双链或单链和双链或单链DNA;DNA; 碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、T4T4 噬菌体多核苷酸激酶和噬菌体多核苷酸激酶和 -32P-ATP; DNA 5DNA 5末端的磷酸根，用碱性磷酸酶去磷酸化，再用末端的磷酸根，用碱性磷酸酶去磷酸化，再用T4T4多核苷酸激酶将多核苷酸激酶将 - -3232P ATPP ATP的的-3232P P转移到转移到 DNA 5DNA 5端的羟基上。端的羟基上。第44页/共76页第四十四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss455 5 - -末端标记末端标记5-pNpNpNpNp3DNAorRNA5-*pNpNpNpNp3+A-p-p(ADP)T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶+ g-+ g-3232P-ATPP-ATP碱性磷酸酶碱性磷酸酶 (eg CIP)(eg CIP)5-NpNpNpNp3第45页/共76页第四十五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss465.RNA5.RNA探针的制备探针的制备体外转录对体外转录对RNARNA的均匀标记的均匀标记 addT7RNApolymeraseandNTPswithone -32P-labelled先克隆合适的模板先克隆合适的模板DNADNA到相应的到相应的转录载体转录载体linearisevectorinMCSdownstreamofinsertRNA moleculeslinearDNAT7T3第46页/共76页第四十六页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss47体外转录法体外转录法第47页/共76页第四十七页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss48内容提要内容提要第一节第一节 核酸标记核酸标记第二节第二节 蛋白质（酶、抗体）蛋白质（酶、抗体）标记标记第48页/共76页第四十八页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss49第二节第二节 蛋白质标记蛋白质标记 抗体抗体-抗原，酶抗原，酶-底物，激素底物，激素-受体蛋白等特受体蛋白等特异性的反应无法直观表现与判断，只有借异性的反应无法直观表现与判断，只有借助发色、发光试剂；或者同位素、酶试剂助发色、发光试剂；或者同位素、酶试剂标记产生高度专一性的探针，利用其作为标记产生高度专一性的探针，利用其作为靶标，又能发出检测信号的特点，提供判靶标，又能发出检测信号的特点，提供判断依据。断依据。第49页/共76页第四十九页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss50一、标记方法一、标记方法1.1.酶标记法酶标记法2.2.荧光染料标记荧光染料标记3.3.生物素标记生物素标记4.4.金标记金标记5.5.同位素标记同位素标记第50页/共76页第五十页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss511.1.酶标记抗体酶标记抗体IgGIgG 辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶与双功能试剂戊二醛偶联到抗体分半乳糖苷酶与双功能试剂戊二醛偶联到抗体分子子IgG IgG ，制成特异性探针。制成特异性探针。 标记物：酶标记物：酶第51页/共76页第五十一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss52第52页/共76页第五十二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss532.2.荧光素染料标记抗体荧光素染料标记抗体 荧光素、罗丹明、德克萨斯红及异硫氰酸荧光素等物质在碱性条件下与抗体分子荧光素、罗丹明、德克萨斯红及异硫氰酸荧光素等物质在碱性条件下与抗体分子IgGIgG发生偶联反应，根据荧光素特异波长及抗体蛋白波长之比值判断其结合量。发生偶联反应，根据荧光素特异波长及抗体蛋白波长之比值判断其结合量。 CyDyeCyDye荧光染料直接标记第二抗体，不需要反应底物，直接扫描进行筛选；或直荧光染料直接标记第二抗体，不需要反应底物，直接扫描进行筛选；或直接掺入接掺入DNADNA，可进行核酸标记。可进行核酸标记。第53页/共76页第五十三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss543.3.生物素标记抗体生物素标记抗体第54页/共76页第五十四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss55蛋白蛋白A-A-金颗粒复合物金颗粒复合物蛋白蛋白A-A-直接结合到胶体金上，直接结合到胶体金上，与免疫球蛋白有极高的亲和作用。与免疫球蛋白有极高的亲和作用。蛋白蛋白A A金颗粒金颗粒4.4.金标记抗体金标记抗体第55页/共76页第五十五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss56免疫胶体金的性质免疫胶体金的性质 免疫胶体金的反应机制：免疫胶体金的反应机制：胶体金是一种由极小的金颗胶体金是一种由极小的金颗粒组成的、带负电荷的、疏水性的胶状体。常用的是粒组成的、带负电荷的、疏水性的胶状体。常用的是5 53030nmnm。 胶体金性能稳定、对细胞无毒性、金颗粒形状规则、胶体金性能稳定、对细胞无毒性、金颗粒形状规则、电子密度高、便于观察和分析。电子密度高、便于观察和分析。 胶体金的金颗粒的直径规格不同，所以能选择差别较胶体金的金颗粒的直径规格不同，所以能选择差别较大的大的2 23 3种，对同一细胞中的不同种抗原进行双重或种，对同一细胞中的不同种抗原进行双重或三重标记，以便进行抗原的定性和定位的比较研究。三重标记，以便进行抗原的定性和定位的比较研究。 胶体金颗粒小，能提高标记的准确性，且容易渗透到胶体金颗粒小，能提高标记的准确性，且容易渗透到细胞质里，甚至细胞质中的一些细胞器里。细胞质里，甚至细胞质中的一些细胞器里。第56页/共76页第五十六页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss57免疫胶体金反应机制免疫胶体金反应机制 胶体金与一抗胶体金与一抗( (直接法直接法) )或二抗或二抗( (间接法间接法) ) 结合，生成免疫抗体或抗抗体复合物，结合，生成免疫抗体或抗抗体复合物，再与细胞中相应的抗原发生特异性免疫反应，形成抗原与胶体金标记的抗体或抗再与细胞中相应的抗原发生特异性免疫反应，形成抗原与胶体金标记的抗体或抗抗体复合物。利用金颗粒的电子密度高，电镜下检测到的金颗粒存在的部位，即抗体复合物。利用金颗粒的电子密度高，电镜下检测到的金颗粒存在的部位，即是所探求的抗原在细胞中的定位。另外通过分析金颗粒的相对密度的高低，还能是所探求的抗原在细胞中的定位。另外通过分析金颗粒的相对密度的高低，还能进行半定量的研究。进行半定量的研究。第57页/共76页第五十七页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss58免疫胶体金反应免疫胶体金反应第58页/共76页第五十八页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss59二、标记物的纯化二、标记物的纯化 萃取沉淀（有机溶剂的选择性沉淀）萃取沉淀（有机溶剂的选择性沉淀） 层析法（凝胶过滤、离子交换、吸附、亲和层析）层析法（凝胶过滤、离子交换、吸附、亲和层析） 离心分离离心分离 电泳分离电泳分离第59页/共76页第五十九页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss60三、探针的鉴定三、探针的鉴定 杂交法杂交法 酸沉淀法酸沉淀法 层析法层析法 比色法比色法 发光法发光法 电子显微镜观察电子显微镜观察第60页/共76页第六十页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss61 放射性同位素标记探针：放射性同位素标记探针：放射自显影。放射自显影。非放射性物质标记探针：非放射性物质标记探针：偶联反应偶联反应+ +显色显色反应。反应。第61页/共76页第六十一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss62第62页/共76页第六十二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss631.1.杂交法杂交法 此法通常是由印迹、杂交和检测分析等步骤组此法通常是由印迹、杂交和检测分析等步骤组成。成。 分子杂交：分子杂交：标记的探针标记的探针DNADNA变性后与变性后的靶变性后与变性后的靶DNA/RNADNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。过程。 分子杂交包括：分子杂交包括：DNA-DNADNA-DNA杂交、杂交、DNA-RNADNA-RNA杂交及蛋杂交及蛋白杂交等。白杂交等。 分子杂交的目的分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂就是运用特异的探针鉴定复杂的靶的靶DNADNA中同源的中同源的DNADNA片段。片段。第63页/共76页第六十三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss64Southern blotSouthern blot 19751975年，英国科学家年，英国科学家SouthernSouthern首创，是指首创，是指DNA-DNADNA-DNA杂杂交，是经典的基因分析方法。交，是经典的基因分析方法。 原理和步骤原理和步骤: : 提取提取DNADNA 限制酶消化限制酶消化 DNADNA片段片段 电泳分离电泳分离 变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜 变性、杂交变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析第64页/共76页第六十四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss65第65页/共76页第六十五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss66斑点杂交斑点杂交(dot and slot (dot and slot hybridization)hybridization) 鉴定核酸序列的简便方法。鉴定核酸序列的简便方法。原理及步骤原理及步骤：提取：提取Cell DNACell DNA 点样品至膜、干燥、固定点样品至膜、干燥、固定 探针、探针、DNADNA变性、杂交变性、杂交 洗膜、放射自显影洗膜、放射自显影 结果分析结果分析第66页/共76页第六十六页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss67Northern blotNorthern blot 是指是指RNARNA印迹法，应用特异性基因探针分析基因的转印迹法，应用特异性基因探针分析基因的转录水平。录水平。原理及步骤：原理及步骤：提取提取 Cell Cell 总总 RNARNA 提纯分离提纯分离mRNAmRNA 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离RNARNA 转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜 杂交检测杂交检测第67页/共76页第六十七页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss68WesternWestern 杂交印迹法杂交印迹法(Western bloting)(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。 主要步骤：主要步骤： 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)(PAGE)电泳电泳 蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：NCNC膜膜 靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应第68页/共76页第六十八页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss69第69页/共76页第六十九页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss702.2.比色法（生物素标记比色法（生物素标记DNADNA探针测定）探针测定）非核素标记的核酸探针可采用印迹、反应和比色等步骤来评估每千个碱非核素标记的核酸探针可采用印迹、反应和比色等步骤来评估每千个碱基对掺入的生物素或地高辛的数量。基对掺入的生物素或地高辛的数量。第70页/共76页第七十页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss713.3.发光法（非核素标记探针测定）发光法（非核素标记探针测定） 化学发光检测也是近年来发展起来的检测手段化学发光检测也是近年来发展起来的检测手段, ,它它需要一定的发光增强剂需要一定的发光增强剂, ,并配有各自的过氧化物酶系并配有各自的过氧化物酶系统。主要是生物素探针与固定在硝酸膜（或尼龙膜）统。主要是生物素探针与固定在硝酸膜（或尼龙膜）上的上的DNADNA结合，生物素与亲合素，过氧化物酶（或结合，生物素与亲合素，过氧化物酶（或碱磷酶）结合，再经过化学发光及增强作用，将光碱磷酶）结合，再经过化学发光及增强作用，将光量放大后，在量放大后，在X X片上发光自显影，将特异结合的片上发光自显影，将特异结合的DNADNA区带显示出来。化学发光检测敏感性高，但需要在区带显示出来。化学发光检测敏感性高，但需要在暗室进行暗室进行X X光片曝光，并且操作要速度，时间要掌握适光片曝光，并且操作要速度，时间要掌握适度，这样就增加了操作难度度，这样就增加了操作难度 。第71页/共76页第七十一页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss72( (一一) ) 鉴定特异性目的基因及外源鉴定特异性目的基因及外源DNADNA的检测的检测 在基因工程中，含有特异性目的基因的重组子，可通过核酸分子杂交进行鉴定。在基因工程中，含有特异性目的基因的重组子，可通过核酸分子杂交进行鉴定。生物工程产品中残留的宿主细胞生物工程产品中残留的宿主细胞DNADNA是一种潜在的与工艺相关的杂质。我们采用非是一种潜在的与工艺相关的杂质。我们采用非同位素法，以长臂光敏生物素标记核酸探针，通过分子杂交检测残留同位素法，以长臂光敏生物素标记核酸探针，通过分子杂交检测残留DNADNA。 四、应用四、应用第72页/共76页第七十二页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss73( (二二) )基因诊断方面的应用基因诊断方面的应用 以基因探针杂交和基因体外扩增两项技术为主干，以转印、电泳、限制性酶切乃以基因探针杂交和基因体外扩增两项技术为主干，以转印、电泳、限制性酶切乃至至DNADNA测序、基因拼接等技术为辅助，使基因诊断逐步成长为一套有广泛用途的、测序、基因拼接等技术为辅助，使基因诊断逐步成长为一套有广泛用途的、高灵敏度、高特异性（能查明一个核苷酸的差异）的医学生物学诊断手段，不同高灵敏度、高特异性（能查明一个核苷酸的差异）的医学生物学诊断手段，不同模式的基因诊断可以随需要而任意选用。模式的基因诊断可以随需要而任意选用。 第73页/共76页第七十三页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss74 例如：斑点或条状杂交模式。例如：斑点或条状杂交模式。 适用于大批量标本的检测，如普查、献血员初筛等场合，每人每天的检测可适用于大批量标本的检测，如普查、献血员初筛等场合，每人每天的检测可以达到以达到10001000个标本以上，如果辅以半自动的样品处理、分子杂交仪等检测数个标本以上，如果辅以半自动的样品处理、分子杂交仪等检测数则可增加数倍，对含多拷贝重复序列的疟原虫检测可达高灵敏度。则可增加数倍，对含多拷贝重复序列的疟原虫检测可达高灵敏度。 第74页/共76页第七十四页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss75（三）表达抗体筛选（三）表达抗体筛选Antibody screening of GT11 expression clones第75页/共76页第七十五页，编辑于星期三：七点 十一分。2022-6-30海南大学农学院wss76感谢您的观看。第76页/共76页第七十六页，编辑于星期三：七点 十一分。