支持细胞的鉴定

牛睾丸支持细胞的鉴定从体外培养形态而言，间质细胞呈多角形或椭圆形，细胞核大而圆，相差显微镜可见胞质内有较多的脂滴；生精细胞呈圆形，以链式或松散形式存在；成纤维细胞呈梭形或扁的星状,具有突起。所以从形态学上不能准确判断Sertoli细胞。根据牛睾丸支持细胞相关特性可以使用下面三个方法鉴定支持细胞。方法一：福尔根染色原理：Sertoli细胞核内存在双极小体结构,而在间质细胞、成纤维细胞和生精细胞内部不存在这种结构。采用Feulgen染色可以鉴定Sertoli细胞核中的卫星核小体,其基本原理是：在60条件下，DNA分子中嘌呤碱和脱氧核糖之间的氢键可被1mol/L盐酸水解打开,游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff）试剂结合，形成紫色复合物。由于从睾丸分离的细胞中，只有Sertoli细胞核内存在卫星核小体结构，能够在细胞核核仁两侧观察到粉色的核小体结构，从而使其区别于其他细胞类型。在Feulgen染色过程中，精准地控制反应体系中的盐酸浓度和的水解时间，是这种方法能够区分出双极核小体的关键。器材： 细胞洗液PBS（）:1L水+8gNacl+0.2gKcl+1.42gNa2HPQ+0.27gKH2PQCarnoy固定液：无水乙醇60mL+冰醋酸10mL+氯仿30mL。 蒸馏水1mol/L盐酸Schiff试剂：5g/L碱性品红溶液100mL煮5min,冷却至50时过滤。滤液+1mol/LHCl10mL+1.5g偏重亚硫酸钠（NaSQ）。在棕色瓶内密封保存13d至颜色变为淡黄色。 福尔根清洗液：100g/L亚硫酸钠溶液5mL+1mol/L盐酸5mL+蒸馏水100mL。乙醇步骤：原代细胞长满后，进行细胞传代培养,待细胞长满后去除培养液，并用PBS（-）冲洗3次，进行福尔根染色 用Carnoy液固定20min; 弃去固定液并用蒸馏水漂洗1min; 用1mol/L盐酸（预热）与贴壁细胞60C孵育8min; 弃去盐酸并加入Schiff试剂，室温下作用45min; 用福尔根清洗液洗3次，每次2min;蒸馏水洗2次，每次1min; 梯度乙醇溶液脱水，并在显微镜下观察、照相。结果判定：染色后的支持细胞胞质不着色，细胞核淡染成粉色，胞质不着色，核内核仁两端有染色较深的多个着色颗粒，这些颗粒为核仁和核内卫星核小体，方法二：免疫细胞化学染色原理：由于Sertoli细胞是睾丸中唯一合成雄激素结合蛋白的细胞,可采用细胞免疫化学法利用鼠抗牛ABP抗体与ABP特异性结合的性质对Sertoli细胞进行染色鉴定。器材：蒸馏水,PBS(-)4%多聚甲醛体积分数3%冰乙酸 SABC试剂盒：50g/LBSA封闭液；;100X稀释的二抗；SABC-APDAB显色试剂盒鼠抗牛ABP单克隆抗体步骤：传至第2代的细胞长满后，去除培养液并用PBS(-)冲洗3次，然进行免疫细胞化学染色。 加入体积分数4%多聚甲醛固定60min; 体积分数3%冰乙酸室温浸泡20min,蒸馏水漂洗1minX2次； 滴加50g/LBSA封闭液，室温下保持20min,甩去多余液体，不洗； 滴加100X稀释的一抗(与抗原结合)，4C过夜。PBS(-)洗2minX3次 滴加SABC-AP,2037C20min,PBS(-)洗5minX4次； 滴加100X稀释的二抗(与抗体结合)，2037C20min,PBS(-)洗2minX3次。DAB显色：取1mL蒸馏水，加入试剂盒中的A、B、C试剂各1滴，混匀后滴于培养皿上室温显色,时间530min,蒸馏水洗涤。结果判定：细胞胞浆和细胞核周围及胞膜棕色，为ABP阳性表达，表明分离的细胞为Sertoli细胞。方法三：油红0染色（原理不明确，不打算用）原理：原理未知油红0染色液的配制：材料：油红染料棕色可密圭寸瓶异丙醇研钵漏斗定性滤纸称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，棕色瓶密封（或锡箔纸包裹避光）4C保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加三蒸水4ml混匀，定性滤纸过滤，稀释（稀释油红储存液，油红：去离子水=3:2，滤纸过滤，室温放置10min）后数小时内用完。苏木素染色液配置：Harrys苏木素苏木素0.1g无水酒精1ml硫酸铝钾2g蒸馏水20ml氧化汞0.05g冰醋酸0.8ml分别用无水酒精溶解苏木素，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即冷却，恢复至室温后过滤备用。10%中性甲醛的配制材料：中性甲醛（多聚甲醛），密封瓶称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的三蒸水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。其他药品及器材：胰酶，PBS50%异丙醇，75%酉精，甘油，载玻片，步骤： 取生长旺盛的第2代细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后制成105/ml的细胞悬液，种植于已预置好小盖玻片的24孔培养板中，放入CO2培养箱中在35、5%CO2条件下进行培养。 当细胞生长至70%融合时取出玻片，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5min. 50%异丙醇固定1min,（是否用多聚甲醛代替） 油红O染色液染色10min, 蒸馏水冲洗3次，每次1min,（是否用75%酉精/60%异丙醇漂洗代替） 苏木素染色5min,分色和返蓝后，显微镜下观察计数？,镜下可见到细胞内中结果判定：油红O染色为睾丸内细胞中支持细胞的特异性染色性脂肪（油滴）被染成红色，细胞核被染成淡蓝色；在细胞核内还看到双极小体油红0染色