蛋白质的复性PPT课件

蛋白质的复性 为什么要进行蛋白质的复性？ 外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产物（ ）时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质的活性。所以要进行蛋白质的复性。 1.什么是包涵体？ 2.为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli ）？第1页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第2页/共45页第3页/共45页蛋白质复性蛋白质复性响时，其本身蛋白质的表达也可出现异常，造响时，其本身蛋白质的表达也可出现异常，造成蛋白质的聚集从而形成包含体。成蛋白质的聚集从而形成包含体。第4页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第5页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第6页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第7页/共45页蛋白质复性蛋白质复性大肠杆菌的重组菌 有多种可选择的质粒；有多种可选择的质粒； 重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；重组遗传背景清楚，基因表达易于控制； 蛋白表达量高（可达总蛋白蛋白表达量高（可达总蛋白5050）；）；第8页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第9页/共45页第10页/共45页蛋白质复性蛋白质复性? 分子伴侣是什么 参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括：核质素，热休克蛋白参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括：核质素，热休克蛋白6060家族（家族（Hsp60Hsp60），热休克蛋白），热休克蛋白7070家族（家族（Hsp70Hsp70），热休克蛋白），热休克蛋白9090家族家族（Hsp90Hsp90）和其他种类的分子伴侣）和其他种类的分子伴侣 ? 分子伴侣对新生肽链折叠的促进作用 使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力；使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力； 在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径? 应用分子伴侣的策略 可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，GroESGroES和和GroELGroEL可显著提高可显著提高D-D-核酮糖核酮糖-1-1，5-5-二磷酸加氧酶二磷酸加氧酶/ /羧化酶（羧化酶（rubiscorubisco）的折叠、）的折叠、组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶A A脱脱氢酶的产量和组装效率；对可溶性氢酶的产量和组装效率；对可溶性-葡萄糖苷酶的表达也有提高葡萄糖苷酶的表达也有提高第11页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第12页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第13页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第14页/共45页第15页/共45页第16页/共45页 蛋白质复性蛋白质复性第17页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第18页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第19页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第20页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第21页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第22页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第23页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第24页/共45页蛋白质复性蛋白质复性值值. (4) 复性溶液中要加入适当的复性溶液中要加入适当的labilizing 试试剂剂,如如L精氨酸精氨酸,可提高复性产率可提高复性产率.第25页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第26页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第27页/共45页蛋白质蛋白质复性复性的影响因素的影响因素 浓度 增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行 温度 蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（40） 蛋白质的聚集将十分严重蛋白质的聚集将十分严重 pH值 通常复性在弱碱性条件下（通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免）进行，但要注意避免 与蛋白的与蛋白的pI值相近值相近 折叠促进剂 L-Arg, PEG, 去污剂去污剂, 尿素和盐酸胍尿素和盐酸胍第28页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第29页/共45页第30页/共45页第31页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第32页/共45页蛋白质复性蛋白质复性红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与 蛋白质浓度对复性的影响第33页/共45页蛋白质复性蛋白质复性 红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度对复性的影响 图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。降低盐酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使系统进入多聚体区和絮凝区。要减少复性的损失，就必须使操作处于复性界限之上。第34页/共45页第35页/共45页第36页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第37页/共45页色谱法复性色谱法复性色谱复性方法原理复性蛋白凝胶色谱凝胶色谱（SEC）蛋白质蛋白质Stokes半径的半径的差异和凝胶排阻作用差异和凝胶排阻作用溶菌酶，牛碳酸酐酶，溶菌酶，牛碳酸酐酶，E.coli宿主整合因子，宿主整合因子，rhETS-1，RNase A，t-PA，Heterodimeric platelet- derived growth factor疏水色谱疏水色谱（ HIC ）蛋白质与介质的疏水蛋白质与介质的疏水性相互结合性相互结合rhIFN-，rhIFN-，重组人粒细胞集落刺激因子重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF离子交换色谱离子交换色谱（IEC）蛋白质与介质间存在蛋白质与介质间存在电荷作用力电荷作用力Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，重组白细胞分泌抑制因子重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白，抗原疫苗蛋白亲和色谱亲和色谱（AFC）蛋白与配体的特异性蛋白与配体的特异性亲和吸附亲和吸附重组人朊病毒重组人朊病毒rhPrion，牛碳酸酐酶，牛碳酸酐酶，IgG第38页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第39页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第40页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第41页/共45页蛋白质复性蛋白质复性第42页/共45页各种重组蛋白质复性方法的比较各种重组蛋白质复性方法的比较复性方法复性率蛋白浓度过程集成性成本传统方法(稀释、透析、超滤)蛋白浓度低时高蛋白浓度高时低低无低改进后传统方法（温度跳跃、分批进料、连续进料）较高较高无较低新方法抗体法高高无高分子伴侣法高高无高人造分子伴侣法高高无较低反向微团法高低无较低双水相法不明不明将包涵体的溶解与蛋白的复性过程集成较低色谱法高高将蛋白的复性与纯化过程集成较低第43页/共45页蛋白质复性蛋白质复性复性效果的检测与评价1.凝胶电泳2.光谱学方法3.色谱学方法4.黏度与浊度5.免疫学方法6.生物学活性及比活性测定第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页