食品微生物指标检测实验方案.docx

微生物学实验方案 题 目：食品中微生物指标检测 班 级：12级食品科学 小组成员：代来鑫 郑君花 张建敏 指导老师：陈莉老师 时 间：2012年10月1 意义 食品微生物指标是指某个或某批食品中微生物的存在与否（定性分析）或每个质量、体积、单位面积或每批产品中微生物存在的数目及其毒素（或代谢产物）的限制（定量分析），用以评价食品的微生物学卫生状况及其安全性。 在我国食品卫生标准中，通常微生物指标包括菌落总数、大肠菌群、致病菌等的检测，其中菌落总数和大肠菌群是必检项目，致病菌不得检出。 食品中微生物菌落总数指食品检样经过处理，在一定的条件下培养后，所得1mL或1g检样中所含菌落的总数，主要作为食品被污染程度的标志，常用倾注平板菌落计数法。大肠菌群是指一群在37，24h能发酵乳糖产酸、产气，需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌，它反映了食品是否被粪便污染，同时也间接地指出食品是否有被肠道致病菌污染的可能性，常用的检测方法是最大可能计数法。2 目的与要求2.1 了解菌落总数、大肠菌群测定在食品卫生评价当中的意义2.2学习并掌握细菌分离和活菌计数的基本方法和原理2.3学习并掌握大肠菌群的检验方法3 实验器材3.1食品检样3.2培养基平板计数琼脂培养基：将胰蛋白胨 5.0 g、酵母浸膏 2.5 g、葡萄糖 1.0 g、琼脂 15.0 g、蒸馏水 1000 mL、pH 7.00.2加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 高压灭菌15 min。月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：将胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g、氯化钠 5.0 g、乳糖 5.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g、磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g、月桂基硫酸钠 0.1 g、蒸馏水 1 000 mL溶解于蒸馏水中，调节 pH 为pH 6.80.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 高压，灭菌15 min。煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：将蛋白胨10.0 g、乳糖10.0 g溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.07.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH为7.20.1，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 高压灭菌15 min。3.3 试剂与器皿3.3.1 试剂 无菌生理盐水：称取8.5氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min。无菌1 mol/L NaOH：称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min无菌1 mol/L HCl：移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121 高压灭菌15 min。 3.3.2 器皿灭菌锅、恒温培养箱：36 1 、冰箱：2 5 、分析天平、振荡器、恒温水浴箱：46 1 、均质器、无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头、pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸无菌锥形瓶：容量250mL/3个、500 mL/3个无菌培养皿：直径90 mm，15个试管：30个玻璃小倒管：20个容量瓶：100mL，2个4 流程 4.1菌落总数检 样25g（mL）样品+225mL稀释液，均质25g（mL）样品+225mL稀释液，均质10倍稀释系列选择3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种营养琼脂培养基（每个稀释度接种两个平皿、取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿中作空白对照）培 养计 数4.1.1样品的稀释固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min，制成 1:10 的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。 4.1.2 培养待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养 48 h2 h。水产品 30 1 培养 72 h3 h。4.1.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。4.1.4结果与报告菌落总数的计算方法：若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算:式中：N样品中菌落数C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n 1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n 2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。示例：上述数据数字修约后，表示为25000或2.5104。若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。菌落总数的报告： 菌落数小于 100 CFU 时，按四舍五入原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用四舍五入原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。4.2 大肠菌群检样25g（mL）样品+225mL稀释液，均质10倍稀释系列选择3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管大肠杆菌群阴性BGLB肉汤报告结果查MPN表产 气不 产 气不 产 气产 气大肠杆菌群阳性5 进度安排第一天下午 玻璃器皿的清洗与灭菌；培养基的制备与灭菌；检样稀释与接种培养第二天下午 观察产气与否，用产气的菌种接种至BGLB肉汤 第三天下午 菌落计数，计数