15-生物化学实验--琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用

琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用 【目的】 1 掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。 2 深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。 【原理】 肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以 FAD 为辅基。它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸， FAD 接受氢生成 FAD2H 。体外实验以美蓝 ( 甲烯蓝 ) 为受氢体，使美蓝还原生成美白 ( 甲烯白 ) 。其反应如下： 琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时间越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔绝空气。 丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。 【器材】 1 研钵与剪刀 2 漏斗 3 纱布 4 恒温水浴 【试剂】 1 0.2mol/L 琥珀酸溶液 2 0.02mol/L 琥珀酸溶液 3 0.2mol/L 丙二酸溶液 4 0.02mol/L 丙二酸溶液 以上四种溶液均先用 5mol/L NaOH 溶液调至 pH7.0 ，再用 0.01mol/L NaOH 溶液调至 pH7.4 。直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。 5 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ） 1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与 1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。 6 0.02% 美蓝溶液 7 液体石蜡 【操作】 1 肌肉提取液的制备 取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约 10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每 克 肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的 pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。 2 酶促反应 取试管 5 支，编号，按下表操作。 试剂（滴） 1 2 3 4 5 肌肉提取液 20 20 20 20 - 0.2mol/L 琥珀酸溶液 4 4 4 - 4 0.02mol/L 琥珀酸溶液 - - - 4 - 0.2mol/L 丙二酸溶液 - - 4 4 - 0.02mol/L 丙二酸溶液 - 4 - - 4 蒸馏水 4 - - - 24 0.02mol/L 美蓝溶液 2 2 2 2 2 将上述各试管液混匀后，沿各管壁加入液体石蜡 5 10 滴，使其在液面形成一薄层以隔绝空气。置于 37 水浴中保温，记录各管保温开始时间及美蓝开始脱色的时间。 3 计算并解释各管美蓝颜色变化原因。 美蓝开始脱色时间保温开始时间美蓝脱色所用时间。 【注意事项】 1 加液体石蜡时宜斜执试管，沿管内壁缓缓加入，不要产生气泡。 2 加完液体石蜡后，观察结果过程中，不要振摇试管，以免溶液与空气接触而使美白重新氧化变蓝。 3 实验完毕，一定要将试管内的液体石蜡洗净。 【思考题】 1 试根据实验现象，说明竞争性抑制作用的特点。 2 本实验的设计原则是什么？ 3 做好本实验的关键环节有哪些？