中药制剂中各类化学成分分析.doc

第五章中药制剂中各类化学成分分析药物分析教研室第一节 生物碱类成分分析一, 概述生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物(如氨基酸,蛋白质和B族维生素等)之外的所有含氮有机化合物,因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性.生物碱绝大多数具有显著的生物活性,且活性是多方面的,因此中药制剂中有含有生物碱类成分的中药时,常选择该中药含有的生物碱成分作为定性定量的依据. 二, 结构特征和理化性质(一)结构特征生物碱大多由C,H,N,O元素组成,极少数分子中尚含有其他元素;大多结构复杂,结构类型较多,主要有杂环类,大环类,萜类,甾类及有机胺类等.结构中的氮原子有多种形式:脂氮,芳氮;季胺,叔胺,仲胺及伯胺;游离状态和与酸结合状态;还有以氮氧配位键形式存在的.此外,结构中除烷烃,羟基取代外还有羧基,酚羟基等酸性官能团及酯键的取代. (二)理化性质1,物理性状多数生物碱为结晶型固体,少数为无定型粉末,还有一些小分子生物碱为液体,例如槟榔碱,菸碱等;液体状的生物碱及个别小分子生物碱尚有挥发性甚至升华性,如麻黄碱具有挥发性,咖啡因具有升华性等.一般生物碱为无色或白色,但结构中具有较长共轭体系,并有助色团的,可显不同颜色.生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子的具有旋光性,并大多与生物碱的生理活性有关,通常左旋体比右旋体生理活性强. 2. 溶解性由于生物碱结构复杂,生物碱的溶解性也是多样化.大多数生物碱成分极性较小,游离状态下难溶于水,易溶氯仿,乙醚,乙醇,丙酮及苯等有机溶剂,与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加,但与生物碱结合的酸不同,生成的盐水溶性也有差异,一般含氧无机酸及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大.季铵型生物碱,有氮氧配位键的生物碱易溶于水,液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂.含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液. 此外一些液体状态的生物碱和分子量较小的固体生物碱,如麻黄碱等具有挥发性.因此,以中药制剂中的生物碱为指标性成分或特征性组分测定时,要注意结合生物碱成分的不同情况采用相应的提取分离及净化方法进行前处理. 3. 沉淀反应大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物,这些试剂称生物碱沉淀试剂.生物碱的沉淀试剂根据其组成有碘化物复盐,重金属盐和大分子酸三大类.生物碱的沉淀反应可以检查中药制剂中生物碱的存在,当某些沉淀试剂与生物碱生成的沉淀组成恒定时,还可以用于中药制剂中生物碱成分的含量测定.但须注意的是中药水浸出液中尚有蛋白质,多肽和鞣质等成分,也可与生物碱沉淀试剂生成沉淀,产生假阳性从而导致错误结论. 因此,用此反应进行中药制剂中生物碱成分的分析时,要用适宜的方法先行处理样品供试液,排除干扰.常用的生物碱沉淀试剂有碘碘化钾,碘化铋钾,碘化汞钾,磷钼酸,磷钨酸,苦味酸,硫氰酸铬酸及四苯硼钠等. 4.显色反应生物碱与一些浓无机酸为主的试剂反应产生不同的颜色,这些呈色反应多用于检识和区别纯品生物碱,而较少用于中药制剂中生物碱成分的分析.生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料(多为磺酸肽类)生成有色络合物,可被氯仿等有机溶剂定量提出;还有些结构中具有酯键的酯碱如乌头碱等可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色,这些特点可用于中药制剂中生物碱成分的分析.5.碱性大多数生物碱呈碱性反应,能使红色石蕊试纸变蓝.生物碱之所以能显碱性,是因为它们分子中氮原子上的孤电子对对质子有一定程度的亲和力,因而表现出碱性. 6.紫外光谱特征结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收,其中包括结构母核即为共轭体系的和只有部分结构为共轭系统的. 紫外光谱的吸收峰位置除与其他化合物一样与共轭系统中助色团的种类,位置,数量有关外,需要特别指出的是,结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱,其吸收峰位置还与测定时溶剂的pH有关. 三,供试液制备进行中药制剂中生物碱成分分析时,制备样品供试液可根据不同情况选用乙醇,甲醇,酸水以及碱化后直接用有机溶剂等溶剂提取,而后进行净化除去干扰成分,净化的方法主要有溶剂法,沉淀法及氧化铝吸附色谱法等.一般要根据:分析目的物是总碱还是单体生物碱;主要生物碱的性质是水溶性生物碱还是脂溶性生物碱,是强碱还是弱碱等;欲使用的分析方法经典的化学法,分光光度法还是色谱法等因素选择溶剂和方法. 四, 定性鉴别目前,用于中药制剂中生物碱成分定性鉴别的方法主要有沉淀法,薄层色谱法,气相色谱法及高效液相色谱法.其中沉淀法和薄层色谱法为中国药典(2005版)收载方法.(一)一般理化鉴别沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法,主要利用生物碱能与一些试剂生成沉淀这一特性.此反应一般在酸性水溶液中进行.由于中药制剂中成分复杂,有些成分如蛋白质,多肽和鞣质等也可与试剂生成沉淀而造成假阳性结果,因此,制备样品供试液时必须净化处理,除去干扰成分,方能用沉淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别. (二)色谱鉴别1.薄层色谱法 薄层色谱具有分离和鉴定双重作用,对于成分复杂的中药制剂用薄层色谱法进鉴别,可得到满意的,可靠的鉴别效果.吸附剂:硅胶或氧化铝薄层色谱,展开剂:多用氯仿,苯等低极性溶剂,加入其化溶剂调整展开剂的极性.由于硅胶显弱酸性,强碱性的生物碱在硅胶色谱板上能形成盐,使Rf值很小或拖尾,形成复斑.在硅胶吸附薄层色谱中,常用碱性系统或在碱性环境下展开.显色剂:常用改良碘化铋钾试剂,有时喷碘化铋钾试剂之后再喷硝酸钠试剂,可使样品斑点更加清晰.亦可用碘蒸气,硫酸铈,碘铂酸等其化的试剂显色.2.纸色谱法纸色谱法可用于生物碱盐或游离碱的鉴别,主要是以水为固定相的正相纸层析,分离效果常取决于流动相的性质.中药制剂中生物碱纸色谱的显色剂基本和薄层色谱法的相同,但含硫酸的试剂不适用. 五,含量测定 生物碱成分含量测定的方法早期常用酸碱滴定法,沉淀法等经典的化学方法.近年多采用分光光度法,薄层色谱法及高效液相色谱法等. (一)总生物碱含量测定化学分析法主要使用酸碱滴定法;强碱滴定生物碱盐时,在70%-90%的乙醇介质中终点比在水中明显,因此常将生物碱盐溶于90%乙醇,再用标准碱乙醇液滴定.若选择的溶剂及指示终点方法合适,还可用非水滴定法进行.分光光度法 分光光度法1,直接测定不经过化学反应,利用生物碱物质自身的光吸收直接进行比色测定的方法;一般用于药味较少,干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定; 2,离子对萃取比色法酸性染料比色法应用本法的关键在于介质的pH,酸性染料的种类和有机溶剂的选择;常用的酸性染料有甲基橙,溴麝香草酚兰(BTB)和溴甲酚绿等;pH的选择要根据染料的性质及生物碱的碱性(pKa)大小来确定;选择有机溶剂的原则是根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱而定.氯仿,二氯甲烷与离子对形成氢键,有中等程度的提取率,且选择性也较好,故是常 用的提取溶剂. 苦味酸盐比色法在弱酸性或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐沉淀,该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂,也可以在碱性条件下解离释放出生物碱和苦味酸. 雷氏盐比色法雷氏盐(NH4Cr(NH3)2(SCN)4H2O)在酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于水的有色络合物. 异羟肟酸铁比色法 含有酯键结构的生物碱,在碱性介质中加热,酯健水解,产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸,再与Fe3+生成紫红色的配合物(异羟肟酸铁),在一定浓度下符合Beer定律,可用比色法进行含量测定. (二)单体生物碱的含量测定1,薄层色谱法 生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本法测定.选用的吸附剂,展开剂及显色方法与鉴别相似,但要求比鉴别严格.使用改良碘化铋钾等作为显色剂时,必须完全挥干展开剂后(尤其在碱性环境下展开时)才可喷洒,否则背景深,反差小,影响测定. 2,高效液相色谱法以反相高效液相色谱应用较多;在反相高效液相色谱中,由于硅胶表面残留硅醇基的影响,使生物碱分析易产生保留时间延长,峰形变宽,拖尾.可采取改进流动相,固定相等措施以克服游离硅醇基的影响,满足定量定量分析的要求.中药制剂中生物碱成分时行高效液相色谱法测定时,使用较多的是紫外检测器. 3,气相色谱法只适用于有挥发性的,遇热不分解的生物碱类;生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测器不利,应该注意;制备供试品溶液时一般应采用冷提取,净化过程也要避免加热,以防成分流失,最后需用氯仿等低极性有机溶剂为溶媒制备成供试液. (三)常见生物碱成分分析中药制剂中含有生物碱成分的中药较多,含有的生物碱成分也很复杂,但作为定性定量的指标性成分.第二节 黄酮类成分分析一,概述黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于自然界的一大类化合物.多具有颜色,在植物体内大部分与糖结合成苷,一部分以游离形式存在.黄酮在藻类,菌类中很少发现;苔藓植物中大都含有;蕨类植物比较普遍存在;裸子植物中也含有但类型较少;黄酮类化合物最集中的是被子植物,类型最全,结构最复杂,含量也高.由这些中药参与配伍的中药制剂也较多见. 二,结构特征及理化性质(一)结构特征黄酮类化合物是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物,现在则是泛指两苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物.在植物体内大部分与糖结合成苷,一部分以游离形式存在.根据基本结构又可分为黄酮,黄酮醇,双黄酮,异黄酮,二氢黄酮,二氢黄酮醇,查耳酮,橙酮,花青素,黄烷等类型.多数黄酮结构中存在有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系,故在200-400nm波长区域内有强烈的吸收带,此是光谱法及色谱光谱法分析的基础.大多黄酮及其苷类含有游离酚羟基,可与聚酰胺形成氢键,可用聚酰胺色谱法进行分析. (二)理化性质1,物理性状黄酮类化合物多为晶性固体,少数(如黄酮苷)为无定形粉末.游离的苷元中,除二氢黄酮,二氢黄酮醇,黄烷及黄烷醇有旋光性外,其余则无.苷类由于在结构中引入糖的分子,故均有旋光性,且多为左旋.2,溶解度 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态(苷或苷元,单糖苷,双糖苷或三糖苷)不同而有很大差异.游离苷元难溶或不溶于水,易溶于甲醇,乙醇,乙酸乙酯,乙醚等有机溶剂及稀碱液中.黄酮苷一般易溶于水,甲醇,乙醇等强极性溶剂中,但难溶或不溶于苯,氯仿等. 3,酸碱性酸性:黄酮类化合物因分子中多有酚羟基,故显酸性,可溶于碱性水溶液,吡啶,甲酰胺及二甲基甲酰胺中.碱性氧原子的性质黄酮类化合物分子中-吡喃酮环上的1-位氧原子,因有未共用的电子对,故表现出微弱的碱性,可与强无机酸,如浓硫酸,盐酸等生成盐,常表现出特殊的颜色,可用于鉴别.生成的盐极不稳定,加水后即可分解. 4,显色反应还原反应:与盐酸镁粉(或锌粉)反应,金属盐类试剂的络合反应:黄酮类化合物分子中多有下列结构,故常可与铝盐,铅盐,锆盐,镁盐等试剂反应,生成有色络合物. 铝盐:常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶液.生成的络合物多为黄色(max=415nm),并有荧光,可用于定性及定量分析.铅盐:常用1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液,可生成黄至红色沉淀.据此不仅可用于鉴定,也可用于提取及分离工作.锆盐:多用2%二氯氧化锆甲醇溶液.黄酮类化合物分子中有游离的3-或5-OH存在时,均可反应生成黄色的锆络合物.但两种锆络合物对酸的稳定性不同,当反应液中接着加入枸橼酸后,5-羟基黄酮的黄色溶液显著褪色,而3-羟基黄酮溶液的呈鲜黄色(锆枸橼酸反应). 5,紫外光谱特征黄酮类由于具有2-苯基色原酮的基本结构,具有特定的紫外吸收峰,常有两个较强的吸收带,I带在300400nm范围内,它是由于B环桂皮酰基引起的,带为240285nm范围内,它是由于A环上的苯甲酰基引起的.黄酮类化合物当加入一些位移试剂如甲醇钠,醋酸钠,氯化铝等,可使最大吸收波长发生位移,选择性提高,还可消除杂质的干扰,有利于含量测定. 三,定性鉴别(一)显色反应黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及-吡喃酮环有关. 常用盐酸-镁粉(或锌粉)反应 与金属盐类试剂的配合反应 黄酮类化合物分子中有游离的3-OH,5-OH或邻二酚羟基时可与Al3+,Zr4+,Pb2+,Sr2+等形成络合物,这些络合物有的产生荧光或颜色加深(如Al3+,Zr4+),有的产生沉淀(如Pb2+,Sr2+) (二)色谱鉴别吸附剂:硅胶,聚酰胺;硅胶色谱分离弱极性化合物较好;聚酰胺色谱他离含游离酚羟游离羟基的黄酮及其苷为佳;纤维素薄层则适用于分离多糖苷混合物;显色反应:采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配合的方法. 四,黄酮类成分定量分析 中药制剂中如含有黄酮类成分,可根据要求测定制剂中的总黄酮含量,黄酮类单体成分的含量或二者同时测定.直接测定:黄酮类化合物具有特定的紫外吸收峰,含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经一定的提取纯化后,可直接于最大吸收波长处测定其吸收度,以芦丁等为对照品计算其含量.显色测定:黄酮类化合物显色以后显色物与背景最大吸收波长差别较大,可消除背景(即阴性空白)的干扰,以提高本法的选择性及灵敏度.常用铝盐作显色试剂.(二)黄酮类单体成分的含量测定1,薄层色谱法样品经有机溶剂或水提取后,可用硅胶,纤维素或聚酰胺进行层析,达到分离目的.层析后可将含有待测组分的色斑刮下,再用适当的溶剂洗脱后,用紫外-可见分光光度法测定.更常用的是薄层扫描仪(单波长或双波长法)直接在薄层板上扫描测定. 2,高效液相色谱法由于黄酮类化合物在紫外区有较强的吸收,使用HPLC法检测灵敏度较高,故该法在黄酮类单体成分的定量分析中最常用.黄酮类成分的HPLC条件他为正相和反相色谱两类,反相色谱应用较多.反相色谱测定多有C18键合相固定液,流动相常用甲醇-水-乙酸(或磷酸缓冲液)及乙腈-水.检测器主要采用紫外检测器或荧光检测器. 第三节 三萜皂苷类成分分析 一,概述 三萜是由30个碳原子组成的萜类化合物,大多数三萜化合物均可看作由6个异戊二烯单位联结而成.游离三萜类化合物通常多不溶于水,而与糖结合成苷后,则大多可溶于水,振摇后可生成胶体溶液,并有持久性似肥皂溶液的泡沫,故有三萜皂苷之称. 二,理化性质溶解度可溶于水,易溶于热水,含水稀醇,热甲醇和热乙醇中,几乎不溶于或难溶于乙醚,苯等极性小的有机溶剂.在含水丁醇或戊醇中溶解度较好,且又能与水分成二相,可利用此性质从水溶液中用正丁醇或戊醇提取皂苷,借以与亲水性的糖,蛋白质等分离.三萜皂苷元能溶于石油醚,苯,乙醚,氯仿等有机溶剂,而不溶于水.显色反应醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard反应);五氯化锑反应(Kahlenberg反应);三氯醋酸反应(Rosen-Heimer反应);冰醋酸-乙酰氯反应(Tschugaeff反应);氯仿-浓硫酸反应(Salkowski反应). 三,定性鉴别:理化鉴别泡沫反应:多用于检验含有皂苷的原料药;化学显色反应:仅在组成药物较少的中药制剂中使用.薄层色谱法由于皂苷类成分大多无明显的紫外吸收,故经薄层色谱分离,然后选用适当的显色剂显色观察,是皂苷定性鉴别中最常用的方法.三萜皂苷类成分进行薄层层析时通常采用硅胶为吸附剂,也有采用氧化铝,硅藻土等为吸附剂.薄层层析后,可选用三氯醋酸,氯磺酸-醋酸,50%及10%硫酸乙醇液,三氯化锑,磷钼酸,浓硫酸-醋酸酐,碘蒸气等显色剂进行显色,其中以不同浓度的硫酸乙醇液为最常用.四,三萜皂苷类成分的定量分析中药制剂中皂苷类成分的定量分析可分为总皂苷测定,皂苷元测定和单体皂苷测定.(一)总皂苷的含量测定1,提取分离总皂苷的含量测定一般需要用适当的溶剂提取.由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大,因此提取溶剂可为各种浓度的甲醇(70%-95%),乙醇,异丙醇,丁醇,戊醇.提取后经分离得到总皂苷成分,分离可用有机溶剂,如水饱和的正丁醇萃取,也可用大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱.2,测定方法重量法该方法主要用于含皂苷的原料药质量控制.在中药制剂中,如处方中药味含皂苷类成分较多时,常用正丁醇作溶剂,测定正丁醇浸出物.比色法常用三萜皂苷显色剂有香草醛-硫酸,香草醛-高氯酸,醋酐-硫酸,高氯酸,浓硫酸以及亚甲蓝等.用比色法测定中药制剂中总皂苷或总苷元的含量时,可选用单体皂苷或皂苷元作对照品,但要注意测定单体皂苷或皂苷元与总皂苷的换算系数.(二)皂苷元的含量测定皂苷元的获得:得到总皂苷后,加酸(如硫酸,盐酸)加热水解,得到皂苷元;将样品先行水解,再用有机溶剂从水解后的溶液中提取皂苷元.测定方法:主要有薄层色谱法,高效液相色谱法和比色法.(三) 三萜皂苷类单体成分含量测定1,薄层色谱法样品经适当的提取,纯化后,用薄层色谱法分离,可排除其他组分的干扰,常用于测定中药制剂中的皂苷元或单体皂苷,定量方法可采用薄层洗脱比色法或薄层扫描法.2,高效液相色谱法大多数三萜皂苷类成分,如人参皂苷,三七皂苷等可利用其在紫外区的末端吸收来检测,但灵敏度相对要低.若中药制剂中所含三萜皂苷类成分本身具有较强的紫外吸收,如甘草酸,远志皂苷等,可用HPLC分离并用紫外检测器检测.蒸发光散射检测器(ELSD)用于高效液相色谱法检测三萜皂苷类成分的应用日渐广泛. 第四节 醌类成分分析一,概述中药中醌类化合物主要有苯醌,萘醌,菲醌和蒽醌四种类型.其中以蒽醌类化合物最为多见,包括蒽醌及其不同还原程度的产物和二聚物,如蒽酚,氧化蒽酚,蒽酮,二蒽酮,二蒽醌等.这些化合物在中药中可游离存在,也可与糖结合成苷,称为蒽苷. 二,结构特征及理化性质(一)结构类型及特征苯醌类苯醌类化合物从结构上可分为邻苯醌及对苯醌两大类.因前者不稳定,故天然存在的苯醌化合物多为对苯醌的衍生物,且在醌核上多有-OH,-OCH3,-CH3等基团或更长的烃类侧链. 对苯醌 邻苯醌 2,萘醌类萘醌化合物从结构上考虑可以有(1,4),(1,2)及amphi(2,6)三种类型.但迄今为止从自然界得到的几乎均为-萘醌类.-(1,4)萘醌 -(1,2)萘醌 amphi-(2,6)萘醌 3,菲醌类天然菲醌衍生物包括邻醌(A)及对醌(B)两种类型.(A) (B)4,蒽醌类蒽醌类成分包括蒽醌衍生物及其不同还原程度的产物,如氧化蒽酚,蒽酚,蒽酮及蒽酮的二聚物等.蒽醌 氧化蒽酚 蒽酮 蒽酚理化性质1,溶解性苯醌及萘醌多以游离状态存在;而蒽醌类则往往结合成苷存在于植物体中;游离的醌类多具有升华性;小分子的苯醌及萘醌类具有挥发性,能随水蒸气蒸馏,可据此进行提取,精制工作.游离醌类多溶于乙醇,乙醚,苯,氯仿等有机溶剂,微溶于或不溶于水.结合成苷后极性增大,易溶于甲醇,乙醇中,在热水中也可溶解,几乎不溶于乙醚,苯,氯仿等非极性溶剂中. 2,酸碱性蒽醌类化合物分子中多具有酚羟基,故具有一定酸性,在碱性水溶液中易溶,但加酸酸化时又可重新沉淀析出,所谓碱提取酸沉淀即是根据这个道理进行的.根据以上性质,醌类化合物的提取可采用碱提取-酸沉淀法.3,显色反应醌类的颜色反应主要取决于其氧化还原性质以及存在的酚羟基的性质.碱性条件下的呈色反应:羟基蒽醌类在碱性溶液中会引起颜色改变并加深.与金属离子的反应:在蒽醌类化合物结构中,如果有-酚羟基或具有邻位二酚羟基时,则可与Pb2+,Mg2+等金属离子形成络合物.与Pb2+形成的络合物在一定pH条件下能沉淀析出,故可用于该化合物的精制.与对亚硝基二甲基苯胺反应:9位或10位未取代的羟基蒽酮类化合物,尤其是1,8-二羟基衍生物,酮基对位的亚甲基上的氢很活泼,可与对亚硝基二甲基苯胺反应,缩合产生各种颜色. 三,定性鉴别1,显色反应将中药制剂用适当方法提取分离,制成供试品液,利用碱性条件下的呈色反应或醋酸镁显色反应等可对羟基蒽醌类成分进行鉴别.2,升华法游离的蒽醌及其他醌类衍生物多具有升华性.中药制剂中如含有这类成分量较大,可采用升华法得到升华物,可见光下观察或加碱性试液显色定性.如大黄流浸膏的鉴别.3,薄层鉴别1)吸附剂:多用硅胶2)展开剂:A:乙酸乙酯-甲醇-水(100:16.5:13.5或相近的比例),适于他离蒽醌苷元和蒽醌苷. B:正丙醇-乙酸乙酯-水(4:4:3)和异丙醇-乙酸乙酯-水(9:9:4),适于分离番泻苷和二蒽酮苷 C:不含水或甲醇的混合溶媒适合于他离蒽醌类的苷元.3)显色方法:主要有喷碱性试剂或醋酸镁甲醇液,氨气熏及在紫外灯下观察荧光,亦可在可见光下直接观察色斑. 四,含量测定蒽醌类成分含量测定1,游离蒽醌的测定中药中含有游离蒽醌的量一般不高,且为脂溶性的,故此部分另用弱极性溶剂如乙醚,氯仿等提取后加碱比色测定. 2,结合蒽醌的测定通常是取游离蒽醌测定项下的药渣将苷提出,水解成苷元后再测定;将药渣先行酸水解,然后用非极性溶剂提取苷元后测定;取待测样品先行酸水解,然后用非极性溶剂提取苷元后测定,其结果为总蒽醌含量,从中减去游离蒽醌含量,即得结合蒽醌的含量. 3,蒽醌类单体成分的测定中药制剂中蒽醌类单体成分的测定一般要将样品水解后再进行测定,测定方法主要有薄层扫描法和高效液相色谱法.薄层扫描法为蒽醌类成分常用定量分析方法,经层析分离后,可在可见光,紫外光及荧光下扫描测定.蒽醌类成分在紫外及可见光下均有强吸收,利用高效液相色谱-紫外可见光检测器测定蒽醌类单体成分,具有灵敏,准确,简便等特点.在含蒽醌类化合物的中药制剂分析中应用日趋增多.第五节 挥发性成分分析 一,概述挥发性成分是指中药中一类具有芳香气并易挥发的成分,其化学组成复杂,主要包括挥发油类成分和其他分子量较小,易挥发的化合物.挥发油为易流动的油状液体,具香味和挥发性,可随水蒸汽蒸馏. 二,结构特征及理化性质(一)结构特征挥发油中成分按化学结构分类,可分为萜类化合物,脂肪族化合物及芳香族化合物等.显色反应挥发油中若含有酚类成分,加入三氯化铁的乙醇溶液,可产生蓝色,蓝紫色或绿色反应;若含有羰基化合物,加入苯肼或苯肼衍生物,羟胺等试剂,可生成结晶性的衍生物;若含有醛类化合物,加入硝酸银氨试液,可发生银镜反应;若含有内酯类化合物,于样品的吡啶溶液中加入亚硝酰铁氰化钠及氢氧化钠溶液,出现红色并逐渐消失;若含有不饱和化合物,于样品中加入溴,红棕色褪去;若含有奥类衍生物,加入浓硫酸,可产生蓝色或紫色反应. (二)薄层色谱法挥发油成分薄层色谱的条件主要是根据极性大小加以分离的.油中所含各类化合物的极性顺序为:烃(萜)醚酯醛,酮醇,酚酸 因此可试用不同极性的展开剂进行分离常用的吸附剂为硅胶,氧化铝等,其中以硅胶常用常用展开剂为石油醚或正己烷,可使不含氧的烃类成分展开,而含氧化合物一般留在原点. 常用的薄层显色剂有:茴香醛-浓硫酸试剂:与挥发油中各成分产生多种鲜艳的颜色.2%高锰酸钾水溶液:在粉红色背景产生黄色斑点时表明含不饱和化合物.荧光素-溴试剂:在长波长的紫外光灯下观察,如薄层斑点显黄色荧光,则表明含乙烯基化合物.2.4-二硝基苯肼试剂:喷试剂后如产生黄色斑点表明可能含有醛或酮类化合物.异羟肟酸铁试剂:喷试剂后如产生淡红色斑点表明含有内酯类化合物 .三氯化铁试剂:斑点显蓝色或绿色,含有酚性物质.0.05%溴酚蓝乙醇溶液:斑点显黄色表明含酸类物质.硝酸铈铵试剂:在黄色背景上显棕色斑点,表明含有醇类物质.对二甲氨基苯甲醛试剂:在80加热10分钟,显深蓝色,可能含类物质.碘化钾-冰醋酸-淀粉试剂:斑点显蓝色表明含过氧化物. 四,含量测定含量测定可分为总挥发油和单一成分的测定.总挥发油的测定,采用挥发油测定器,用蒸馏法测定,可分别测定相对密度在1.0以下和1.0以上的挥发油含量. 单一成分测定:主要采用气相色谱法和薄层色谱法. 第六节 木脂素类成分分析一,概述木脂素是一类在生物体内由二分子苯丙素衍生物聚合而成的化合物. 二,理化性质溶解性游离的木脂素具亲脂性,一般难溶于水,在石油醚中溶解度较小,易溶于苯,氯仿,乙醚,丙酮及乙醇等有机溶剂,具有酚羟基的木脂素类还可溶于苛性碱水溶液中.木脂素与糖结合成苷时则亲水性增加,对水的溶解性增大,也可溶于甲醇,乙醇.显色反应木脂素类没有共有的特征颜色反应,但对于一些非特征性试剂如磷钼酸乙醇溶液,硫酸乙醇溶液等,不同的木脂素化合物可显示不同的颜色,常用于薄层色谱的显色.Labat 反应 可作为具有亚甲二氧基的木脂素的特征反应,化合物加浓硫酸,再加没食子酸,可产生蓝绿色.Ecgrine反应 如以变色酸代替没食子酸,并保持温度在70-80,20min,可产生蓝紫色. 紫外光谱特征多数木脂素的UV光谱具有苯环的特征吸收,并且其二个取代芳环是二个孤立的发色团,UV吸收峰位置在250350nm之间,吸收强度是二者的总和,立体结构对紫外光谱影响不大,苯环上取代基可影响峰的位置.四.定性鉴别一般理化鉴别利用木脂素分子结构中的功能基具有的颜色反应来检识它们.色谱鉴别中国药典(2005版)中凡以木脂素成分为指标进行检测的,使用的方法均为薄层色谱法.木脂素类成分一般具有较强的亲脂性,采用吸附色谱法可获得较好的分离效果,常用硅胶薄层色谱.显色方法大多用香草醛试剂和10%浓硫酸试剂, 110加热5min,除此之外还可用5%10%磷钼酸乙醇液,碘蒸气熏后呈黄棕色或置紫外灯下观察荧光. 五.含量测定总木脂素成分含量测定总木脂素类含量测定方法可采用变色酸比色法,二阶导数光谱法及柱色谱比色法等.变色酸比色法是根据某些木脂素成分,其结构中亚甲二氧基与变色酸/浓硫酸试剂反应产生颜色进行比色测定含量,本方法要求供试液纯度较高.单体木脂素成分的含量测定薄层色谱法:以硅胶为吸附剂,低极性有机溶剂展开.高效液相色谱法:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-水或甲醇-水系统为流动相,多用紫外检测器测定. 第七节 其他类型成分分析 (一)概述概念:有机酸按结构可分为三类,即脂肪类,芳香族类和萜类.按羧基数目可分为单羧基酸,二羧基酸和三羧基酸.(二)定性鉴别薄层色谱法吸附剂:常用硅胶,聚酰胺等.展开剂:常用极性较大的溶剂,为防有机酸展开过程中发生离解,常在展开剂中加入一定比例的甲酸或乙酸等以消除因解离而产生拖尾现象.显色剂:常用pH指示剂,如溴甲酚绿,溴甲酚紫,溴酚蓝,磷钼酸试剂等.具有荧光的物质如绿原酸,阿魏酸等,可不必显色,在荧光灯下观察荧光.(三)含量测定酸碱滴定法本法适合于测定总有机酸类成分,由于中药中有机酸类成分酸性弱,在水溶液中滴定突跃不明显,可用非水溶液滴定法.滴定液颜色较深时,影响观察滴定终点,采用电位法指示终点.高效液相色谱法芳香族酸类和其他具有紫外吸收的酸类,可用高效液相色谱法进行含量测定,如绿原酸,没食子酸,桂皮酸,丹参素,阿魏酸等. 分光光度法 可用单波长法,双波长法,导数分光光度法测定有机酸的含量.薄层扫描法脂肪酸类,萜类等一些不具有紫外吸收的酸类物质可用薄层色谱分离,再选用合适的显色剂,显色后测定.脂肪酸类如苹果酸,丁二酸,丙二酸,枸橼酸,酒石酸可用溴酚兰,溴甲酚绿等pH指示剂为显色剂;萜类物质如熊果酸,齐墩果酸可用硫酸乙醇,磷钼酸试剂等为显色剂.可产生荧光的化合物可用薄层分离后用荧光法测定,如阿魏酸,绿原酸等化合物. 二,环烯醚萜类成分分析(一)概述概念环烯醚萜:一类特殊的单萜,由二个异戊二烯构成,含有10个碳原子,其母核都为环状,具有烯键和醚键,常与糖结合成苷.溶解性:大多易溶于水,甲醇,可溶于乙醇,丙酮,正丁醇.对酸敏感:成苷后苷键易被水解断裂,苷元结构中C1的羟基和C2位的氧是一个半缩醛结构,化学性质活泼,易发生进一步氧气化聚合等反应,尤其在酸碱作用下更易变化.(二)定性鉴别利用薄层色谱可对环烯醚萜苷类成分进行定性鉴别.薄层板:(1)硅胶G;(2)硅胶GF254;(3)聚酰胺薄膜.显色剂:(1)硫酸乙醇溶液;(2)茴香醛试液;(3)香草醛硫酸试液;(4)对二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液.(三)含量测定高效液相色谱法:对于有紫外吸收的环烯醚萜苷类成分可用该项法进行分析.薄层扫描法:可用硅胶GF254薄层,检测荧光熄灭斑点;也可用硅胶G薄层,用显色剂显色后测定.分光光度法:利用环烯醚萜苷与某些试剂的呈色反应,于分光光度计上测定吸收度进行定量分析. 三,香豆素类成分分析(一)概述概念:香豆素是一类内酯衍生物,具有芳香气,分子中苯环或吡喃酮环上常有取代基存在,按其基本的环状结构形式,分为简单香豆类,呋喃香豆素类,吡喃香豆素类,其他香豆素类.(二)理化性质显色反应 异羟肟酸铁反应内酯环在碱性条件下开环,与盐酸羟胺缩合成异羟肟酸,然后再在酸性条件下与三价铁离子配合成盐而显红色. 与酚羟基反应具有酚羟基取代的香豆素类在水溶液中可与FeCl3试剂产生颜色.若香豆素化合物的C6位上(即酚羟基的对位)没有取代基,则能与Gibbs试剂反应显蓝色.香豆素类成分在碱性溶液中加热,使内酯环开裂,若酚羟基对位无取代基,则可与重氮化试剂反应生成红色偶氮染料. 紫外光谱特征化合物的结构中羰基和芳环形成较强的共轭体系,因此在紫外光区具有很强的特征吸收,紫外吸收光谱一般在300nm左右(lg为4左右)有最大吸收,吸收峰的位置与取代基有很大关系.香豆素母核本身无荧光,而羟基香豆素在紫外光下大多数能显蓝色荧光,这是因为羟基能增强分子荧光的缘故.香豆素类荧光的有无或强弱与分子中取代基的种类和位置有关.香豆素的荧光性质在薄层色谱中可用于定性鉴别和定量分析. (三)定性鉴别荧光法羟基香豆素大多能产生荧光,利用此性质可进行定性鉴别.可直接观察提取溶液的荧光,也可观察薄层斑点荧光.薄层色谱法具有荧光的香豆素类成分,可用薄层色谱荧光法进行鉴别不具荧光或荧光强度较弱的香豆素可用显色剂或喷洒碱溶液以增强荧光再进行观察.(四)含量测定1,分光光度法利用香豆素类成分的颜色反应,生成有色物质,于可见光波长区域进行测定.香豆素类成分都具有紫外吸收,样品较纯净时,也可于紫外光区域直接测定. 2,薄层扫描法本法为香豆素类成分常用测定方法之一,样品经薄层分离后,于荧光灯下定位,利用香豆素类成分具有紫外吸收或能产生荧光的特性,不经显色,直接进行扫描测定. 3,荧光光度法羟基香豆素类成分大多能产生较强烈荧光,用荧光光度法进行测定有较高的灵敏度.当干扰成分较多时,可先用薄层分离,刮取薄层洗脱被测成分后再用荧光光度法进行测定,但本法不及薄层扫描法简便,刮取薄层洗脱时易引起误差. 4,高效液相色谱法香豆素类成分含有芳香环及其它共轭结构,用HPLC测定时,有较高的灵敏度,常用固定相为C18,流动相为不同比例的甲醇水,5,气相色谱法某些分子量小,具有挥发性的香豆素类成分,可用气相色谱法测定,如蛇床子素,欧前胡素,香柑内酯,异虎耳草素,花椒毒素,花椒毒酚等成分可用GC测定,常用SE-30石英毛细管柱,FID检测器. 四,单萜及二萜类成分分析 1,含芍药苷中药制剂的分析(1)定性鉴别芍药苷的定性鉴别,多用薄层色谱法.可用硅胶GF254薄层板分离后于紫外光灯(254nm)下直接观察,但斑点色泽较浅,也可用显色剂显色后进行鉴别.常用的薄层吸附剂为硅胶G,硅胶GF254,显色剂有:10%硫酸乙醇溶液;5%香草醛硫酸溶液;5%茴香醛-5%硫酸乙醇溶液;稀盐酸;碘蒸气.(2)含量测定具有紫外吸收,但不能产生荧光,在硅胶GF254薄板上可产生暗色斑点,所以芍药苷常用的定量方法为高效液相色谱法和薄层扫描法. 2,含穿心莲中药制剂的分析 结构中含有,不饱和内酯,其紫外吸收光谱为max223nm,可利用此结构特性进行鉴别和含量测定 .定性鉴别:多采用薄层色谱法进行鉴别具有紫外吸收,在硅胶CF254薄层板上呈现暗斑点,也可用硅胶G薄层,用显色剂显色后进行观察.常用的显色剂:A碘蒸气;B2%的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与7%氢氧化钾溶液的等量混合液.含量测定穿心莲总内酯的测定可根据内酯结构在pH=8以上水解开环的性质,用氢氧化钠水解,以酸回滴剩余碱间接测定总内酯含量;利用比色法测定;用以上两种方法测定总内酯含量时,要注意其他杂质的干扰,需要经过净化预处理再进行测定;穿心莲单体内酯的测定薄层分离后用紫外分光光度法测定用薄层扫描或高效液相色谱法测定五,多糖多糖又称多聚糖(polysaccharides),通常是由D-葡萄糖,D-半乳糖,L-阿拉伯糖,L鼠李糖,D-半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等十个以上的单糖基通过苷键连接聚合而成的高分子物质.理化性质无甜味,无还原性.一般分为两类,一类为水不溶的,主要是形成动植物的支持组织,如纤维素,甲壳素等,分子呈直糖链型;另一类为动植物的贮存养料,可溶于热水成胶体溶液,如淀粉,肝糖元等,多数为支糖链型. (二)鉴别1. 薄层色谱法多糖可采用酸水解法将其水解成较小片段,然后进行薄层色谱鉴别.硅胶色谱,纤维素色谱,硅藻土色谱及氧化铝色谱.由于糖是多羟基化合物,极性强容易吸附,采用含有无机盐水溶液,如0.3mol/L磷酸二氢钠水溶液制备硅胶薄层板,使硅胶薄层吸附能力降低,斑点集中,对分离有所改善,样品承载量显著提高. 2. 纸色谱法多糖可采用酸水解法将其水解成单糖,然后进行纸色谱;也可用某些系统直接将多糖展开.总多糖的测定3.5-二硝基水杨酸(DNS)比色法在碱性溶液中,3.5-二硝基水杨酸与还原糖生成棕红色氨基化合物,在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系,利用比色法可测定样品中糖含量.苯酚-硫酸法苯酚-硫酸试剂可与游离的或多糖中的已糖,糖醛酸起显色反应,已糖在490nm波长处,戊糖及糖醛酸在480nm波长处有最大吸收,吸收度与糖含量呈线性关系. 蒽酮-硫酸法糖类与硫酸发生脱水反应,生成糠醛或其衍生物,可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm波长处有最大吸收,吸收度与多糖含量呈线性关系. 单体多糖的含量测定单体多糖多采用高效凝胶液相色谱法,以已知分子量的多糖对照品作对照,确定其分子量.再将其酸水解后进行高效液相色谱法测定,确定其组成(单糖的种类及比例),以单糖的量推算多糖的量.检测器多为示差折光检测器,通常用氨基键合硅胶柱分离,但其稳定性差,用硅胶柱动态改性,可避免这一问题.