银杏复方制剂对脾虚小鼠消化酶活性的影响研究.doc

银杏复方制剂对脾虚小鼠消化酶活性的影响研究 龙岩学院生命科学学院06级动物医学班王千金 摘要：采用日龄一致，体重大致相近的KM种雌性小鼠为试验材料，研究银杏复方制剂对脾虚小鼠小肠消化酶活性的影响。结果表明：银杏复方制剂显著提高了脾虚小鼠学小肠消化酶的活性，说明对脾虚小鼠的脾虚有明显的改善。关键词：银杏叶；复方制剂；脾虚；消化酶银杏树（Ginkgo biloba）是世界上残存的最古老的植物之一1。银杏别名公孙树,系银杏科银杏属落叶乔木,是中国的特种植物, 70%的银杏资源产于中国。银杏的药用价值主要是在其叶和果实，银杏叶被用作药物已有500余年的历史，早在宋朝就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎。银杏叶甘苦涩，平，入肺，脾，胃三经。功效为敛肺止咳，化湿止泻，主要用于治疗治胸闷心痛，心悸怔忡，痰喘咳嗽，泻痢，白带。而其叶的提取物已经广泛运用于医学和其他的相关领域，但是以银杏叶为主要原料的复方制剂用于治疗脾虚小鼠还是少有报道。本实验中银杏复方制剂是以银杏叶为主要原料配合黄芩、白术、党参等中草药研制而成。黄芩为唇形科植物,黄芩( scutellaria baicalensis georgi)的干燥根,味苦,性寒,具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效2。主要用于治疗湿温，黄疸，泻痢，热痢，高热烦渴，肺热咳嗽，胎热不安。白术，甘、苦、温，归脾、胃经。具有补气健脾，燥湿利水，固表止汗，安胎功能等功效。主治泄泻、痰饮、水肿、黄疸、湿痹、头晕、自汗、小便不利、胎气不安等症3。党参具有补中益气，健脾益肺的功效。用于脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消渴等。本草从新记载：“补中益气、和脾胃、除烦渴。中气微弱，用以调补，甚为平妥。茯苓性味甘淡平，入心、肺、脾经。具有渗湿利水、健脾宁心之功效。临床上常用于治疗水肿尿少、痰饮眩晕、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠等症4。茯苓之利水，是通过健运脾肺功能而达到的。本文利用银杏复方剂对脾虚小鼠的治疗，采用消化酶试剂盒对小鼠的肠道消化酶的测量，为进一步开发和利用银杏复方剂为科学提供科学的实验和理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1银杏叶干粉由长沙博健生物科技有限公司提供，产品标准号：Q/ADPG001-2008；黄芪、党参、白术、茯苓购于福建紫金医药连锁有限公司，质量符合中华人民共和国兽药典（2005版）标准。1.1.2利血平注射液（1mg/mL），广东邦民制药有限公司生产，产品批号080307。1.1.3 实验动物 6周龄KM种小鼠，雌性，体质量2328g，购于福建医科大学实验动物中心。1.1.4 淀粉酶、碱性磷酸酶、脂肪酶、胰蛋白酶、考马斯亮兰测定试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司1.1.5仪器离心机、水浴锅、漩涡混匀器、720型分光光度计。2.试验方法2.1银杏叶复方制备：将银杏叶干粉、黄芪、党参、白术、茯苓5种药物按照5:2:1:1:1的比例混匀，采用水煮醇提的方法，首先分别用8倍、6倍和5倍量水煎煮1h，混合煎煮液并浓缩至100 mL，再将煎煮液分别用75%和85%的乙醇混合过夜，并调节pH值到7.0左右，去除沉淀后用旋转蒸发仪浓缩，制得每mL含有1g生药的浓缩液。2.2实验性脾虚证模型小鼠的建立 依据中医脾虚证诊断参考标准5，选择利血平造脾虚模型，使用剂量参考文献进行6。通过动物试验，以小鼠便溏、食欲减少、消瘦、呆立、群聚、活动明显减少等明显脾虚体征为脾虚证模型复制成功，确定小鼠脾虚证模型使用剂量为0.2mL /kg。2.3 实验动物分组KM种小鼠60只，雌性，随机分为对照组、脾虚模型组和银杏叶复方组。每组设5个重复，每个重复4只小鼠。对照组给予生理盐水，分别灌胃（0.3 mL /d）和腹腔注射（0.2mL /kg）；脾虚模型组给予生理盐水灌胃（0.3 mL /d）和腹腔注射利血平（0.2mL /kg），于第三天出现与文献报道相符的症状；银杏叶复方组分别给予银杏叶复方制剂（0.3 mL /d）灌胃和腹腔注射利血平（0.2mL /kg）。每天给药1次，连续14d。2.4 样品制备小鼠在结束造模后，禁食1夜，于次日上午从每个重复组取一只小鼠，断颈处死后分别取十二指肠、空肠、回肠，仔细剥离肠系膜和脂肪。用10 mL注射器（侧开口，保护肠壁）吸取4生理盐水冲洗肠腔，尽量将肠内容物冲洗干净。冲洗过的小肠平铺于滤纸上，纵向剖开肠段，暴露粘膜面，再用4生理盐水冲洗一遍。试验中做淀粉酶、碱性磷酸酶、脂肪酶的组织匀浆的操作过程是：组织匀浆的制备开始先取组织块在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，大约于0.200g左右放置于研钵中，在冰浴条件下，按要求加相应比例的生理盐水进行研磨（淀粉酶、碱性磷酸酶的组织：生理盐水为1：9；脂肪酶的组织：生理盐水为1：4）。而捣碎后迅速放入离心杯中，将制备好的匀浆用普通离心机3000r/min左右离心15分钟，取上清液于离心管中。胰蛋白酶的样本是先取组织块在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，大约于0.200g左右放置于研钵中，然后按照重量体积比1：9（组织：样本匀浆介质）进行研磨。在冰浴条件下，充分匀浆，所制得的悬浮液2500转/分，离心810分钟，上清即为10%的匀浆,取上清液于离心管中。组织匀浆蛋白含量采用考马斯亮兰法测定。2.5小肠的淀粉酶的测定将1 g 组织蛋白中的淀粉酶(AMS) ,在37 条件下与底物淀粉作用30 min ,水解10 mg淀粉为一个淀粉酶活力单位。2.5.1实验步骤测定管空白管底物缓冲液（ml）37预温5分钟0.50.5待测样本（ml）0.1 混匀，37水浴，准确反应7.5分钟碘应用液（ml）0.50.5蒸馏水（ml）3.03.1混匀，660nm波长，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。先进行样本最佳取样浓度摸索，确定最佳取样浓度后进行测量淀粉酶的活性。2.6小肠的碱性磷酸酶的测定每克组织蛋白在37与基质作用15分钟产生1mg酚为1单位。2.6.1实验方法测定管标准管空白管1%组织匀浆（ml）0.030.1mg/ml酚标准应用液（ml）0.03爽蒸水（ml）0.03缓冲液（ml）0.50.50.5基质液（ml）0.50.50.5 充分混匀37水浴15分钟显色剂（ml）1.51.51.5立即混匀，520nm，0.5cm光径比色，空白管调零，测各管吸光度。2.7小肠的脂肪酶的测定将1 g 组织蛋白中的脂肪酶(LPS) , 在37 条件下与底物反应1 min ,每消耗1mol 底物为一个淀粉酶活力单位。2.7.1将底物缓冲液，37预温5分钟以上。2.7.2将分光光度计于420nm处以Tris缓冲液调零。2.7.3往相应的编号试管内加入0.025ml20%的组织匀浆，再键入试剂四0.025ml，然后用5ml加样器吸取4ml预温的底物缓冲液冲入试管中，迅速用冰箱保鲜膜盖住管口，再用拇指摁住，立即颠倒混合5次（切勿过分用力放振摇，以免引起气泡）。2.7.4迅速导入比色皿中在分光光度计420nm处比浊，读取吸光度值（A1值）2.7.5将此比色液倒入原试管中置37准确水浴10分钟，再用上法比色读取吸光度值（A2值）2.7.6求出2次吸光度差值（A= A1 -A2）注意点：20%组织匀浆的制备：准确称取组织湿重，按照重量体积比1：4（克：毫升）的比例加入生理盐水，冰浴中进行匀浆，然后2500转/分离心10分钟,取上清液进行测定。比色皿每次比色前要用温蒸馏水洗涤干净后再进行下次比色。因水浴时间只有10分钟，所以待测试管最好每批不要超过3支，否则来不及做。2.8小肠的胰蛋白酶的测定在PH8.0，37条件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为一个酶活力单位。2.8.1实验方法反应温度：37；反应时间：20分钟；比色：0.5cm光径石英比色皿，253nm蒸馏水调零。试剂名称空白测定胰蛋白酶底物应用液（ml）1.51.5 37预温5分钟样本（ml）0.015样本匀浆介质（ml）0.0152.9数据处理采用Excel软件进行分析方差分析，结果以平均值标准差表示。3.结果与分析小鼠小肠（十二指肠、空肠、回肠）消化酶的影响见表1、2、3.表1： 十二指肠淀粉酶碱性磷酸酶 脂肪酶 胰蛋白酶对照组试验组模拟组0.0810.00460.0730.004A0.0690.004B207.228.9128.513.2A104.73.8B163.420136.515.6A91.523.9B3385.5742.42585.7262.3A2010.8124B表2： 空肠淀粉酶碱性磷酸酶 脂肪酶 胰蛋白酶对照组实验组模拟组0.0860.00760.0820.0035A0.0710.0032B214.212.4146.817.1A115 9.7B177.67.6120.82.6A91.917.7B3408.2504.82390.2235.9A1845137.4B表3： 回肠淀粉酶碱性磷酸酶 脂肪酶 胰蛋白酶对照组实验组模拟组0.0820.00660.0780.0044A0.0690.0059B194.515.7134.430.7A98 6.7B 119.722.5 100.60.88a78 18.8Bb3111.1 374.52514.6 294.4A2039.7 177.5B注：大写字母、小些字母分别代表0.01、0.05水平显著。由以上的3个表中可以看出，对照组中十二指肠、空肠、回肠的淀粉酶的活性极显著高于实验组（P 0.01），实验组的淀粉酶的活性极显著高于模拟组（P 0.01），同时对照组的淀粉酶活性极显著高于模拟组（P 0.01）；对照组中十二指肠、空肠、回肠碱性磷酸酶的活性极显著高于实验组（P 0.01），实验组的碱性磷酸酶的活性极显著高于模拟组（P 0.01），对照组的碱性磷酸酶的活性极显著高于模拟组（P 0.01）；对照组的十二指肠、空肠的脂肪酶的活性极显著高于实验组（P 0.01）；实验组的十二指肠、空肠的脂肪酶的活性极显著高于模拟组（P 0.01），对照组的回肠的脂肪酶的活性显著高于实验组（ P 0.05），实验组的回肠的脂肪酶的活性显著高于模拟组（ P 0.05），对照组中十二指肠、空肠、回肠胰蛋白酶的活性极显著高于实验组（P 0.01），实验组的胰蛋白酶的活性极显著高于模拟组（P 0.01），对照组的胰蛋白酶的活性极显著高于模拟组（P 0.01）。4.小结与讨论4.1利血平可以耗竭动物体内的儿茶酚胺。一定剂量的利血平能使动物引起与中医脾虚症类似的症状7。而中医理论中脾位于腹中，其经脉络与胃，与胃构成表里关系。其主要生理功能是主运化，运化即消化、吸收。小肠上通于胃，因而小肠与脾是息息相关的。小肠的主要生理功能是受盛化物和分别清浊，即小肠接受由胃传来的水谷，继续进行消化吸收以分别清浊。清者为水谷精微，经吸收后，由脾传输到身体各部，供机体活动之需；浊者为糟粕和多余水液，下注大肠或肾，经由二便排出体外。脾是一个以消化系统为主的多脏器多系统的综合功能单位,脾虚时大量器官会出现基因水平、分子水平、细胞水平的变化,从而引起组织结构和功能的改变,其中消化酶的变化更显突出8。4.2试验中采用以银杏叶为主要原料配合黄芩、白术、党参等中草药研制而成的银杏复方剂。有研究9，银杏叶的提取物健脾益气、养阴活血化淤,达到减毒增效作用，因而银杏叶对脾虚模型小鼠有明显的治疗作用。而复方剂中的配方黄芩归肺、胆、大肠、小肠经。因而会让水谷精微经吸收后，由脾传输到身体各部，使机体的机能得到有效改善。依据中药原理，黄芩补气生血，甘温，能补脾、肺之气，活血化瘀，可促进血清和肝脏蛋白质代谢，其多糖能能明显促进实验动物脾脏内抗体形成，增加机体非特异性免疫力10。有报道11，黄芩中的主要成分黄芩多糖对脾虚小鼠的消化功能有很大的作用，改善改善脾虚小鼠小肠的吸收功能。同时也有研究12，黄芪活性成分提取物会提高肉仔鸡消化酶活性。而对于白术，中医学认为，白术为补脾专药，有利于胃肠消化、吸收的功能，具有补脾燥湿的作用。脾喜燥而恶湿，白术甘温益脾胃之阳气，燥脾胃之寒湿，故为补脾益气之要药13。因而将其制成银杏复方剂，对治疗脾虚小鼠有很大的帮助。有研究表示14，参苓白术散对脾虚小鼠具有肠道菌群调整及促进损伤肠组织恢复的作用。党参甘平，入脾、肺经，可补气健脾、助消化15。茯苓具有利水消肿、健脾宁心的功效。因而将银杏叶粉配合黄芩、白术、党参、茯苓制成的银杏复方剂，对脾虚小鼠的治疗有好的疗效。因而由此组成的一个复方制剂在针对脾虚小鼠的治疗很有科学依据。4.3由实验分析可以看出，注射银杏复方剂的脾虚小鼠的消化酶活性会比模拟组小鼠的消化酶高，说明银杏复方剂能够提高小鼠消化酶的活性，能够健脾、助消化，能够提高脾虚小鼠消化酶的活性。参考文献：1 MAJOR R T. 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