炮制对槐米黄酮含量及抗氧化活性的影响-开题报告.doc

安徽科技学院本科生毕业论文（设计）开题报告书题目炮制对槐米黄酮含量及抗氧化活性的影响学生姓名 王林学号1336120220专业班级中药学121班教师姓名俞浩职称教授研究目的意义及国内外研究状况和应用前景（附参考文献）：1.研究目的意义 探讨炮制对槐米黄酮含量及抗氧化活性的影响，为临床提供依据。2. 国内外研究状况和应用前景 槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L.)的干燥花蕾，具有凉血止血、清肝泻火的功能，在神农本草经中，将槐米列为上品。而槐米不同炮制品具有不同的药理活性和功效，临床上槐米的常用炮制品主要有生品、炒槐米和槐米炭3种。为了研究不同炮制品功效间的差异，研究者运用各种方法和手段，研究槐米炮制前后所发生生化学成分含量的变化与功效间的关系。结果表明，在炮制过程中，随着温度的升高，黄酮类物质会受热分解，产生鞣质类成分。由此看，炮制温度是影响产品黄酮含量及其活性的重要因素。因此，研究不同炮制温度对黄酮类类物质含量的影响对指导临床指导用药具有一定意义1。 随着食品工业发展人们消费观念逐渐趋向于具有合理营养和保健功能的营养保健食品。目前，槐米除了作为临床用药，也被我国卫生部列为药食兼用植物，属于保健食品基料。槐米中所含的黄酮类成分属于多元酚类化合物，结构上具有较多的苯羟基，而具有这种结构的化合物往往在抗氧化方面表现突出，因此槐米提取物具有很明显的抗氧化活性，能清除机体内氧自由基，从而达到保护机体的作用。在人们追求天然抗氧化剂的今天，槐米极有可能作为一种具有保健功能的新型抗自由基食品添加剂使用。但在制作各类食品时，所使用的烹饪方法和温度是不同的，因而探讨不同炮制方法对槐米中黄酮含量的变化及其相应的抗氧化活性，对于解决从原料到成品及货架期易氧化酸败等问题具有重要的应用价值。这会为我国中草药作为食品添加剂的开发利用另辟一条新路，也为延缓高脂食品的自动氧化酸败提供很好的解决思路，而且对医药卫生、营养学均有重要的实际意义2。 祖国医学认为槐米性味苦平，系豆科植物槐的花蕾，具有清肝明目、凉血止血、清热降血脂等功效；甘草性味甘平，系多年生草本植物，具有补脾益气、止咳祛痰、清热解毒和调和药性功能3。现代研究表明，槐米的功能因子是芦丁，属于黄酮醇类化合物；甘草的功能因子是甘草苷，属于二氢黄酮类化合物。从黄酮类物质结构上可以得知，苯环上带有羟基，具有一定的抗氧化能力，可以抑制脂肪的氧化酸败。 本论文通过对中药槐米的炮制品抗氧化活性进行研究，开发了一种新型高效食品抗氧化剂，对于解决从原料到成品及货架期易氧化酸败等问题具有重要的应用价值。这为我国中草药作为食品添加剂的开发利用另辟了一条新路，也为延缓高脂食品的自动氧化酸败提供了很好的解决思路，而且对医药卫生、营养学均有重要的实际意义。3.炮制工艺与化学研究 陈善信、赵荣华等以中国药典炮制法制备样品，对槐米炮制前后不同制品的鞣质和黄酮含量变化进行了测定，结果认为炒槐米和醋炒槐米，均可使鞣质含量增高。其中醋炒槐米鞣质含量升高程度比炒槐米稍多(一般认为，鞣质含量越高，则止血作用增强，这与中医理论认为醋味具收敛性，对止血可起协同作用的看法是一致的)。两种炮制品芦丁含量较生品稍高，可能与加热处理过程中，槐米部分有机物质破坏，而使芦丁含量相对升高所致。表明传统的炮制方法是与临床相吻合的4。 崔学义等以传统炒炭操作方法制备样品，考察了槐米炒炭的投料量相同，炒炭温度、炒制时间各不相同对槐米进行炒制。其得炭率基本一致。以氧化还原法测定槐米炭中的鞣质含量，以槐米取样量按出炭率算取，相当10 g生槐米，生品含鞣质0.745% ，不同炮制条件下制得的三种槐米炭，鞣质含量基本一致(分别为:5.50% ,5.46% ,5.38% )，也说明槐米传统制炭是有道理的5。 赵伟康等按常规加工炒制炭，对槐米炒炭质量进行深入研究，发现槐米炒炭过程中，鞣质含量开始急剧增加的同时芦丁显著降低。炒制温度达190时，槐米炭中鞣质含量是槐米的6倍，温度继续上升，则形成的鞣质又开始破坏，当温度超过250时，槐米炭中的鞣质几乎全部分解。并用纯芦丁进行对照加热炒炭实验。其转化为鞣质的温度，最高峰为230当超过这个温度时，鞣质也被破坏6。 原思通等用烘法(远红外辐射电子恒温烤箱烘烤)，制备槐米炭，(选取150 250 )2组21份槐米炭及槐米中的芦丁，作定温定时加热烘烤，然后测定各样品中鞣质的芦丁含量，结果表明，烘制温度在150190范围内，随着温度的升高，鞣质含量也相应增加，185195加热炒30 min，所得槐米炭鞣质含量增至生品的56倍，当温度超过200时，鞣质和芦丁均有不同的分解破坏，至250时，其含量降至生品中鞣质含量的1 /5或1 /3以下，在测定芦丁时，发现芦丁受热后，可转化成鞣质。且主要为缩合鞣质。实验说明，槐米制炭温度的受热时间，是影响成品中鞣质含量以及芦丁转化成鞣质的重要因素，所以槐米“炒炭存性”可增强收敛止血作用，这似于鞣质含量增加和部分芦丁留存有关7。 王晓红以红外烘烤法，选用5种温度和时间指标进行烘烤炮制，研究温度对槐米中鞣质含量的影响，结果表明，154烘烤的槐米中鞣质含量最高，215鞣质损失殆尽。江文君等用DC-50型中药微机程控炒药机，设定不同炒制度等工艺参数，观察外观形状及收得率，并对其鞣质含量进行测定，实验结果表明，饮片受热温度范围是影响槐米炭鞣质增量与减量的关键性因素，炒药机的功能可保证槐米炭外观与内在质量的均一稳定。与槐米170以下炒制鞣质变化不明显，170190内受热，鞣质含量迅速升高达数倍，190以上受热，鞣质含量开始下降，230左右受热，鞣质量可降至生品含量以下，实验与其变化规律相符8。 邓水荣等以烘炭法制备槐米炭样品，并进行鞣质和芦丁的含量测定及小鼠出血时间的研究比较，结果认为，160烘4 min基本上可代替传统炒炭法，且烘制法能定时、控温、减少劳动强度，具有一定可行性9。 曾诠等应用正交设计对槐米进行炮制并以槐米中所含的鞣质、芦丁、槲皮素为指标，研究槐米炭炮制工艺。试验数据经多指标试验公式评分处理，得出最佳制炭工艺方案，即铁锅温度250，加热时间为10 min，药材投料为190 g，槐米温度为150。并提示，槐米温度应控制在210以下，在194 210范围为宜，出炭率控制在82%83%。因在实验中发现，槐米温度超过210 ，三成分均下降。倪永兴等应用多指标试验全概率公式评分法结合正交设计，以槐米中所含鞣质、芦丁、槲皮素为指标，探讨槐米炭炮制工艺，获最佳方案为，即铁锅温度220，加温时间20 min，药材投料190g10。 盛瑞才等按中国药典方法炒炭制备样品，并对蒲黄、槐米、栀子、侧柏、牡丹皮等五种中药炒炭后的微量元素含量进行光谱分析。结果表明，各样品制炭后，具有止血作用。用等离子光谱法和原子吸收光谱法通过对制炭后样品中微量元素含量测定研究，表明，槐米、栀子、侧柏三种药材制炭后，其所测Zn，Cd，Co，Cu等10种元素的含量均明显升高。并分析炭药中微量元素的升高，除药材制炭后元素富集的原因外，还和炒炭过程中发生的物理、化学变化有关11。参考文献：1 范巧宁,高晓梅,赵珮,等.不同提取方法对槐米多糖抗氧化活性的影响J.食品工业科技,2014,35(21):273-277.2 杨娜，朱开梅，顾生玖.从槐米中提取槲皮素方法的研究进展J.时珍国医国药.2010，21（12）：3340-3341.3 谢宗立.大剂量槐米泡剂治疗尿路结石J.中医药研究.1994，16（4）：34.4 金念祖，朱燕萍，赵鸿雁等槲皮素及槐米提取物对小鼠Lewis肺癌的抑瘤实验研究J.南京中医药大学学报.2005,21（2）：108-110.5 念其滨.槐米不同炮制品的鞣质含量测定J.福建中医药.2004，35（2）：48.6 陈宇杰，马丽杰，李静，等.槐米对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及机制J.中药药理与临床.2014;30(5).100-102.7 刘丽丽，王涛，李晓霞，等.槐米化学成分研究J.辽宁中医药大学学报.2014，16（7）：51-53.8 赵新芝，郭长强，韩莉，等.槐米炮制研究进展J.时珍国医国药.2000，11（2）：183-184.9 张军，王家宏，王丽娟，等.槐米水提液对训练小鼠运动能力影响的机制研究J.自然科学版.2007,35（4）：100-101.10 沈密,马存林，王飞，等.槐米提取物的抗氧化性能研究J.自然科学版.2012,33（6）：72-75.11 史方超，乔立业，苏华，等.槐米提取物的制备工艺及其紫外吸收特性考察J.中国医药导报.2015，12（22）：18-22.12 余静，茅力，朱燕萍，等.槐米提取物对小鼠Lewis肺癌移植瘤细胞周期和PCNA表达的影响J.中药新药与临床药理.2005,16（3）：164-168.13 杨建雄，王丽娟，田经伟.槐米提取液对小鼠抗氧化能力的影响J.自然科学版.2002，30（2）：87-90.14 李飞，李秋红，李廷利.槐米有效成分含量测定方法研究进展J.中医药信息.2008，25（4）：19-21.15 江培，何杏，王金宏.槐米中多糖的提取和含量测定J.黑龙江医药.2013，（2）：166-169.16 全先高,刘君，韩秀媛，等.槐米中提取芦丁的实验研究J.济宁医学院学报.2008，31（4）：293.17 郭亚力，李聪，欧灵澄，等.槐米中天然抗氧化剂的提取及其抗自由基性能研究J.食品科学.2004,154-157.18 赵宇新.槐米中主要成分变化规律与受热温度的相关性N.中国实验方剂学杂志.2011,19(17):108-110.19 刘会敏，王志玲,刘景东，等.槐米中主要黄酮苷员成分的分析J.自然科学版.2015,39(7):253-256.20 张凤清，徐永苗，丁璞.五中提取方法对槐米抗氧化性能的影响J.食品科技.2008,33(11):174-176.21 廖华卫，邓金梅，宋粉云.正交法优化槐米中芦丁的提取工艺N.广东药学院学报.2006,22(3):275-276.一、主要内容采用超声波提取法提取不同炮制品槐米总黄酮，采取紫外分光光度计的方法测定不同炮制品槐米的含量。通过对DPPH自由基的清除来测定不同炮制品槐米抗氧化活性，通过以上的方法来探究不同炮制方法对槐米黄酮含量以及抗氧化活性的影响。二、研究思路2.1.1槐米不同炮制品的制备生槐米制备：取生槐米经粉碎机粉碎，过20目筛筛选，即得生槐米样品。炒槐米制备：取生槐米置于铁锅中，以小火或中火翻炒，按照清炒法（附录II D）炒至表面深黄色，经粉碎机粉碎，过20目筛筛选，即得炒槐米样品。槐米炭制备：取生槐米置于铁锅中，以武火翻炒，按照炒炭法（附录II D）炒至表面焦褐色，经粉碎机粉碎，过20目筛筛选，即得槐米炭样品1。2.1.2槐米总黄酮提取分别精密称取3g槐米不同炮制品的粉末，加入60mL 70%乙醇，在超声波提取机（温度60，功率300 W，频率45kHz）作用下提取60min，抽滤后，用70%乙醇溶液定容至100mL，取1mL溶液于10mL容量瓶中用70%的乙醇定容至刻度线备用10。2.1.3槐米不同炮制品总黄酮含量测定分别吸取不同槐米炮制品总黄酮提取液1.0mL，放置于10mL 容量瓶中，加入 2.4mL70%乙醇，摇匀；加入0.4mL5%亚硝酸钠，摇匀，静置6min； 加入0.4mL10%硝酸铝，摇匀，静置6min；加4%氢氧化钠4mL，摇匀，最后用70%乙醇定容至刻度，静置15min，在510nm 处测定吸光度7。总黄酮类物质含量（%）=Y*V*n/M*106式中：W为样品黄酮类物质提取率（%）；Y为提取液黄酮类物质质量浓度（ug/mL）；V为提取液体积（mL）；n为稀释倍数；M为槐米质量（g）。2.1.4芦丁标准溶液的配制用分析天平准确称取芦丁样品2.0mg,放置于10mL 容量瓶中,并用 70% 乙醇溶解并定容至刻度线,放在超声波提取机中超声溶解,即配制成浓度为0.2mg/mL 的芦丁样品溶液。2.1.5标准曲线制备分别精密吸取芦丁对照品溶液 0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL 置于 5 个10mL 容量瓶中，各加入 2.4mL 70%乙醇，摇匀；加入 0.4mL 5% 亚硝酸钠，摇匀,静置 6min；加入 0.4mL 10%硝酸铝，摇匀，静置6min；加4%氢氧化钠4mL，摇匀,最后用30%乙醇定容至刻度,静置15min。以相对应的试剂为空白对照,在510nm 处测定吸光度，用横坐标表示吸光度，用纵坐标表示浓度9。2.1.6精密度试验精密吸取1.3.5中对照品溶液2.0mL，连续进样5次，测定其吸光度，并计算其RSD值，若RSD值小于3%时，即说明仪器精密度良好。2.1.7稳定性试验取不同炮制品槐米溶液1.0mL，按1.3.5条件下分别在0、4、8、12、24min测定其吸光度，计算RSD值，若RSD值小于3%时，即说明仪器稳定性良好。2.1.8重现性试验取不同槐米炮制品样品各5份，每份约3g，精密称定，按1.3.3的方法进行操作，按1.3.5进行吸光度测定，分别吸取1.0ml进行测定，并计算含量，并计算RSD值，若RSD值小于3%时，即说明样品重现性良好。2.1.1 槐米不同炮制品对DPPH（1,1-二苯基-2-苦苯肼）自由基消除率试验方法10不同炮制品槐米提取物乙醇溶液的制备：称取100mg不同槐米炮制品于250mL容量瓶中,加入70%乙醇至刻度,摇匀,即得0.4mg/mL,置于试剂瓶中，放在阴暗处备用。分别取1.6mL不同炮制品样品溶液,加入4mL DPPH自由基溶液,用70%乙醇补充至容量瓶的刻度线处,摇匀,20min后,以70%乙醇作比照，在517nm处用紫外分光光度计测其吸光度；将样品用等体积水代替，即体系中仅含有DPPH自由基溶液和70%乙醇,其他同前,测定吸光度。另将DPPH自由基溶液用等体积水代替，即体系中只含有样品和70%乙醇，其他同前,测定吸光度。按下式计算DPPH自由基的清除率：K=1-A-B/C*100%式中：K为DPPH自由基清除率；A为加样品溶液和DPPH后溶液的吸光度；B为不加DPPH，只加溶液的吸光度；C为不加样品溶液，只加DPPH溶液的吸光度。2.1.2 槐米不同炮制品对羟基自由基消除率试验方法11硫酸亚铁溶液配制:准确称取55.60mg硫酸亚铁（FeSO47H2O）置于100mL容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度线处,摇匀,即得1.8mmol/L，置于棕色试剂瓶中。0.3%H2O2溶液配制:用移液管吸取1mL溶液于100mL容量瓶中,加入70%乙醇稀释至刻度线处,摇匀,置于棕色试剂瓶中。水杨酸溶液配制:准确称取110.5mg水杨酸于100mL容量瓶中,加入无水乙醇稀释至刻度线处,摇匀,即得1.8mmol/L,置于棕色试剂瓶中。不同槐米提取液配制:称取0.1g不同槐米炮制品于250mL容量瓶中，加入无水乙醇至刻度,摇匀,0.4mg/mL置于棕色试剂瓶中。在10mL容量瓶中依次加入1.8mmoL/L FeSO4 3mL、1.8mmol/L水杨酸3mL,摇匀,然后分别加入0.4mg/mL的槐米提取物溶液0.8mL,最后加3mL0.3%H2O2，然后加蒸馏水补充至10mL，37水浴加热20min，取出测其吸光度A，以不加待测液，只加各种溶剂测其吸光度为B,按下式计算待测液对羟基自由基清除率：K=(B-A)/B*100%式中：K为羟基自由基的清除值；A为加试样和溶剂后溶液的吸光度,B为不加试样,只加各种溶剂后溶液的吸光度。总体安排和进度（包括阶段性工作内容及完成日期）：2015年10月15日之前 与指导老师探讨毕业论文题目，选定题目2015年10月16日-12月15日 收集槐米相关文献资料、撰写文献综述2015年12月16日-12月31日 拟定论文提纲，设计实验内容2015年12月1日-2月5日 根据所查文献，完成开题报告2015年12月26日-2016年1月30日 根据设计实验内容，做毕业论文实验2016年3月16日-4月15日 根据实验所得数据，完成初稿2016年4月16日-4月30日 与指导老师讨论，完成修改稿2016年5月1日-5月27日 完成定稿，准备答辩指导教师意见（研究的意义、创新点、前期基础工作、存在的难点和困难、建议等）：指导教师签名： 年月日学院领导组意见： 签名： 年月日