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第五章 肿瘤发生的分子生物学基础第一节 概 述肿瘤的发生与基因密切相关，基因突变或基因表达失常是肿瘤发生的关键。从分子上来考察一个肿瘤细胞的产生、发展和形成，则是细胞大分子结构和功能改变及细胞小分子代谢失常的结果。RNA、蛋白质分子的变异源于DNA或基因的改变。细胞小分子代谢失常来自代谢酶的改变。细胞生长、发育、分裂、分化、衰老、凋亡的改变来自于生长因子、生长抑制因子、激素、受体、细胞骨架蛋白及各种细胞多肽或蛋白质的变异。但追溯其源，其本质和核心乃是DNA分子上的基因结构、功能改变和表达异常所致。肿瘤分子生物学，正是从研究细胞内生物大分子的结构与功能改变和细胞内各种小分子代谢失常入手来探讨癌变产生的分子机制的。癌基因、抑癌基因、代谢基因、修复基因、等的改变与肿瘤发生的关系得到了广泛的研究。生长因子、生长抑制因子、激素、信号传递蛋白质、受体、各种生物活性多肽和蛋白质、细胞周期蛋白、细胞骨架蛋白等基因产物，在肿瘤发生中的作用也同样得到了众多的研究。这些研究，从不同侧面正在逐步构画出基因、DNA、RNA、蛋白质的结构和功能改变是如何不断地将一个正常细胞转变为癌细胞的基本轮廓。第二节 肿瘤产生的分子基础一、DNA的结构、性质和功能改变 DNA是双螺旋结构的分子。当细胞分裂时，双螺旋问的氢键打开成为2股单链，每股单链以自身为模板，通过碱基配对原则复制出完全互补的另一条链，形成2个完全相同的DNA分子。继而2个相同的DNA分子随着细胞分裂平均分配于2个子细胞中，实现其遗传性状的稳定性。然而，DNA分子维系的遗传稳定性是相对的，其改变则是不可避免的。DNA分子结构的改变主要来自3方面的冲击： DNA分子的自发断裂和碱基的丢失； DNA自我复制造成的错误； 各种各样的致癌剂对DNA分子的损伤作用。致癌剂对DNA分子的损伤作用是DNA分子结构改变中最重要的原因。其结果是造成DNA分子结构、性质和生物学功能的改变。碱基对的改变，是DNA分子结构改变中最基本的方式。其主要形式有替代、缺失、插入、颠换等几种情况(图5-1)。DNA分子上碱基对的排列顺序负载着特定物种的遗传密码信息。只要有一对碱基改变，DNA分子上的三联体密码的框码就会移动和错排。碱基对改变后的DNA分子已经不再是原来物种的遗传物质，而是变异的遗传物质.DNA加成物的形成是DNA分子结构改变的重要方式之一。a.DNA加成物的形成是DNA分子结构改变重要方式（图5-2）。b.X射线引起DNA结构改变。c.烷化剂，多环芳香烃等致癌物改变DNA的结构。d.紫外线引起DNA结构改变。e.病毒引起DNA结构改变：病毒整合到细胞DNA。DNA结构改变易分解为单链，使DNA的复制和转录活性增加：DNA的复制准确性的降低是DNA性质改变的另一个重要特征。DNA复制的准确性，是保持遗传稳定性的关键所在。在致癌物的作用下，DNA链上的碱基往往会发生改变。未经致癌物作用的DNA与致癌物作用的DNA分子的碱基组成亦不相同。通过核酸单链构象分析(SSCP)，可以方便地测出DNA上碱基的改变。DNA上碱基改变导致DNA结构改变，就会使DNA的性质和复制准确性改变，最终可导致细胞的突变。二、RNA和蛋白质的结构、性质和功能改变mRNA分子以DNA分子的一条链为模板，在RNA聚合酶的作用下转录出的单链核糖核酸分子。它负载着一条多肽链上氨基酸排列顺序的密码。从分子结构改变的DNA上转录出的mRNA与从正常DNA分子上转录的mRNA是不相同的。DNA的结构、性质和功能的改变，是RNA和蛋白质的结构、性质和功能改变的根源。而蛋白质的结构、性质和功能的改变则直接影响细胞的增殖、生长控制、分裂速度、功能分化。一个细胞的增殖失去分化，癌变就会发生。第三节 DNA损伤DNA损伤的类型 DNA分子的结构改变是致癌剂对DNA损伤造成的结果。DNA的损伤往往伴随DNA结构的改变。从DNA链的完整性观察，致癌剂对DNA的损伤类型有：双链断裂；单链断裂；链交联；片断丢失等（图5-3）从DNA分子上碱基的变化看，致癌剂对DNA的损伤类型有： 碱基二聚体形成； 碱基加成物形成； 碱基缺失； 碱基取代和碱基错配等（图5-4）。第四节 癌基因一、概述存在于正常细胞中未被激活的癌基因，称为原癌基因（protooncogene）。当原癌基因被激活后才能转变为癌基因。二、种类癌基因种类繁多，按原癌基因产物的功能，则可以把癌基因分为生长因子与生长因子受体类、蛋白激酶类、G蛋白功能类和核内蛋白类等四大类（表6-3）。三、癌基因产物的作用机制鉴于癌基因种类繁多，其编码的癌基因产物更是功能众多，作用机制复杂，但癌基因属于调控基因，癌基因产物必然与细胞内的信号传递、蛋白质活化、酶的激活、转录的启动和调节、细胞分裂与分化过程等各个环节相关。目前已经发现了四大类癌基因产物，大都属于此列。四、癌基因与肿瘤 存在于正常细胞中的癌基因为原癌基因。原癌基因是细胞基因组的正常成分。只有当某些因素作用后，原癌基因的结构改变和激活才会导致调控失常。激活后的癌基因才具有致癌活性。因此，原癌基因的激活是导致肿瘤产生的关键因素。原癌基因的激活有多种途径，主要激活方式有点突变、基因重排、基因扩增等类型。 1点突变 在基因的编码顺序上某一核苷酸发生的突变叫点突变，点突变是癌基因激活的重要方式。从膀胱癌细胞株T24中克隆出的转化基因为c-H-ras癌基因；与正常的C-H-ras原癌基因编码顺序的差异，仅是第35个核苷酸由G变成了T。因此，C-H-ras编码的p21蛋白第12位氨基酸由甘氨酸变成了缬氨酸，细胞因此获得了转化能力。这种改变与多种癌的因果关系已经查出。如乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、急性髓性白血病、神经母细胞瘤等癌瘤细胞中均发现了ras原癌基因的点突变。 2基因重排 原癌基因中某一部分从一个位置移到另一位置可改变原癌基因的结构，使原癌基因激活，这种改变称为基因重排。对trk癌基因与大肠癌、乳癌、乳头状甲状腺癌的发生关系研究证明即是基因重排的结果。在大肠癌、甲状腺肿瘤中，可以发现trk激酶区的结构未变，而trk蛋白的膜外部分或是易位改变或是发生了替换。基因重排使trk原癌基因变成具有转化活性的癌基因。90的人慢性粒细胞白血病中也发现Cabl原癌基因的易位。 3基因扩增 某些原癌基因复制时可以由一个拷贝而转变为多个拷贝。原癌基因拷贝数的增加会导致基因产物的增加，从而引起细胞正常功能的紊乱。在神经母细胞瘤、小细胞肺癌、网织细胞瘤中均可见到N-myc基因的扩增。 原癌基因的激活，导致细胞的生长调控异常和癌变。在一个癌瘤细胞中，一般不止存在一种原癌基因的激活。多个原癌基因在肿瘤发生的多个阶段上，相继或同时被激活。目前认为，在癌变过程中至少有2类原癌基因被激活才能完成癌变过程。一类是使细胞产生不死性的癌基因，这类癌基因通常分布于细胞核中，如myc癌基因等；另一类是细胞迅速增殖，细胞表面形态和功能改变的癌基因，这类癌基因通常分布于细胞质中，如ras癌基因，在致癌过程中myc和ras癌基因互补才能使细胞恶变。总之，原癌基因的激活引起癌基因的高表达影响细胞的增殖分化。正常细胞将在增殖速度和功能分化方面发生改变。因此，一个正常细胞就会变成一个转化细胞和癌细胞。 4缺失 基因的缺失也是基因失活或激活的一个重要方式。缺失可发生于一二个碱基，也可以发生基因的一部分缺失。缺失可能是肿瘤产生的原因，也可能是细胞恶性转化后的结果。从染色体5q、13q、17q、18q等位点所克隆出的抑癌基因，均有抑制细胞转化和肿瘤发展的功能。但它们的缺失，往往会导致肿瘤的形成。染色体的缺失，也可能是细胞转化过程中遗传不稳定性的结果。DNA在外界因素作用下可以发生突变。如果DNA修复功能不佳，细胞就会通过已经突变的基因遗传给子代，获得突变基因的子代细胞最终形成肿瘤。这种基因缺失也可视为肿瘤产生的结果，缺失在抑癌基因失活中表现的尤为重要。 第五节 抑癌基因一、概述 1983年，Benedict等人对散发型和遗传型视网膜细胞瘤的基因突变进行了分析，发现突变发生在位于13号染色体臂1区4带（13q14）的Rb基因上。Rb基因丢失或失活，就会失去抑制细胞恶变的能力。 Rb基因是世界上第一个克隆出的完成全序列测定的抑癌基因。Rb基因的发现也使肿瘤学进入到了以抑癌基因为标志的新时代。二、种类 从基因克隆、抑癌基因突变、抑癌基因产物的性质和功能，到它们与肿瘤发生的关系等方面的研究，都取得了较大进展。新的抑癌基因不断地发现，使抑癌基因研究成了现代肿瘤学研究的主旋律。什么是抑癌基因？从概念上讲，凡能产生直接或间接抑制细胞增殖、癌变的肿瘤抑制基因即为抑癌基因。 按抑癌基因的功能进行分类，据此把抑癌基因分为两大类：抑癌基因产物与癌基因产物直接作用；抑癌基因对癌基因的表达起负调节作用，包括转录和转录后（表6-4）。三、抑癌基因产物的作用机制1.Rb基因产物Rb基因编码的105 ku的pRb蛋白为核内磷酸化蛋白。在细胞周期的不同时相中pRb的状态不同。在G1期pRb处于低磷酸化状态；当细胞开始向S期转化时，pRb的磷酸化急剧增加并持续到G2期和M期，之后又回到G1期低磷酸化状态。pRb可以和细胞转录因子E2F结合，这种结合可以参与细胞从G1期向s期过渡的调节。大T抗原和E1A、E7蛋白可以与E2F竞争性地对pRb结合，从而阻断细胞从G1期向S期的过渡，因此认为，pRb对Go和G1期细胞起负调节作用。表5-4 抑癌基因的分类抑癌基因 对细胞生长的负调节抑癌基因产物与癌基因 不可逆地终止增殖产物直接作用核内（例如p53、Rb、erbA） 细胞生长静止细胞浆（例如NF-1、K-rer-1） 终止分化抑癌基因对癌基因的表达起负 衰老调节，包括转录或转录后 坏死可逆地终止生长外来的（可溶性生长抑制剂）内在的（阻断信息传递或细胞周期） 表5-5 主要抑癌基因的性质和功能名称 功能 分子质量或氨基酸Rb 细胞周期蛋白 105 kuP53 核内转录因子 53 kuWT-1 DNA结合蛋白 345 aaDCC 受体 190 kuMCC 受体 829 aaerbA 核内激素受体 ？2p53基因产物p53基因编码的p53蛋白是一个53 ku的核内转录因子蛋白。过去将p53列为癌基因是由于它可以与ras基因共同转化大鼠原代细胞，后来才发现过去用来做实验的p53基因是突变型的p53基因。而野生型的p53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。p53的作用特点是它以四聚体形式与DNA结合来调节基因表达，四聚体中任何一个单体突变就不能使四聚体与DNA结合。最近的研究表明，p53对细胞周期也发生影响。在2个p53等位基因均受损的细胞接受离子辐射或某些药物时，p53基因会发生突变。这些p53基因突变的细胞会进入S期。而含野生型p53基因的细胞在接受上述刺激后，p53表达升高，细胞周期停止在G1期，从而使细胞有足够的时间进行受损DNA的修复。如果受损的DNA能够被修复，细胞就进入S期。如果受损DNA不能被修复，细胞就会进入程序化死亡。由此可见，野生型p53发挥着细胞周期调节的功能。有报告说，野生型p53是通过GADD基因对细胞周期调节的。野生型p53基因可通过与DNA上的早启动因子结合，从而启动下游CAT报告基因的表达。突变型的p53不能启动报告基因的表达。在p53基因信号传递下游还存在mdm-2基因，这个基因编码一个p90蛋白，p90蛋白与野生型p53蛋白结合，可解除p53介导的G1期细胞停滞。3.WT-1基因产物WT-1基因编码着一个由345个氨基酸组成的DNA结合蛋白。WT-1蛋白与EGR-1的DNA结合蛋白相似，它具有同样的DNA结合序列。EGR-1接受血清因子刺激可迅速表达，并激活细胞增殖。若WT-1蛋白与特定的DNA序列结合后，就阻止了EGR-1对DNA的结合，从而抑制了EGR-1对转录的激活作用，WT-1蛋白即是以此对细胞生长进行抑制的。 4.DCC基因产物DCC基因，编码着一个分子质量为190 ku的跨膜磷酸化蛋白。DCC蛋白是一个细胞豫中的信号传递受体。已经发现多发性息肉结肠癌中存在着DCC基因的缺失，这种缺失可能使细胞获得生长优势。DCC蛋白与一种细胞粘附分子的结构非常相似，细胞间正常粘附作用的丢失可导致肿瘤细胞的扩散和转移。DCC蛋白可能在恢复细胞的黏附作用上破挥作用。 5.MCC基因产物 MCC基因编码一个含有829个氨基酸的蛋白质，部分序列与G蛋白结合的一种受体相似。在散发型直肠癌中可以检出MCC基因的错义突变。MCC蛋白可能代替G蛋白受体与G蛋白结合来改变或阻止信号的传递。 6.erbA基因产物从一种禽类成红细胞增多症病毒株AEV-ES4/R中，发现了2种病毒基因：一种叫V-erbB；另一种为V-erbA。V-erbB和V-erbA有相反的功能。V-erbB可以促进细胞转化，而V-erbA可以阻止细胞进入终末分化而停留在高度增殖的未成熟状态。有人把V-erbB归为癌基因类，把V-erbA归为抑癌基因类。1986年证实C-erbA是一种高亲合性甲状腺受体基因。erbA蛋白可与DNA结合，羧基端可与激素结合。甲状腺素正是通过与C-erbA蛋白结合对转录造成影响进而对体内的糖代谢、脂代谢以及中枢神经系统发育产生作用，但确切的作用机制尚不清楚。 四、抑癌基因与肿瘤细胞癌变是一个复杂的过程。单从癌基因和抑癌基因的大量研究结果看，这个过程应包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。在结肠癌中，可以发现癌基因K-ras的点突变、18号染色体长臂上抑癌基因DCC的丢失、17号染色体短臂上p53基因的突变或丢失。在乳癌中也可以见到C-erbB-2和C-myc癌基因的扩增和高表达，同时也可看到p53基因突变和丢失以及Rb基因的丢失。在肺癌中可以发现C-myc、N-myc的扩增和过量表达，同时也有p53基因、Rb基因的改变。在胶质细胞瘤中也可见到erbB-1、C-myc、neu/erbB-2、N-myc、ros、sis等癌基因的激活，也可以看到p53基因的突变。在胃癌中，同样可以看到H-ras点突变、C-myc扩增和hst重排，同时也存在p53基因的点突变。这些研究结果都证明了癌基因激活和抑癌基因失活是肿瘤发生的重要原因。 第六节 生长因子与肿瘤一、生长因子概念 生长因子是一类与细胞受体结合，具有调节细胞生长作用的生物多肽分子。生长因子最初由它们具有促进细胞增殖的作用而得名，所以在很长时间内，正性促进细胞生长成为生长因子的基本属性。随着具有抑制细胞增殖的“负性生长因子”的发现，扩展了生长因子的范围。生长因子既包括促进细胞生长的多肽分子，也包括抑制细胞生长的多肽分子。在细胞生长繁殖过程中，生长因子的促进和抑制总是成对或配套地发挥作用。生长因对细胞的生长调节作用只有在与细胞膜上的受体结合后，触发一系列细胞内信号的传导，激活或抑制不同基因的表达，才能影响细胞的增殖或分化。如果生长因子、受体及信号传导途径发生异常，就可能导致组织发育异常和一系列包括肿瘤在内的慢性疾病的发生。因此，生长因子与肿瘤发生的关系研究受到了人们的高度重视。二、生长因子的分泌和种类三、作用机制生长因子对细胞增殖的调控作用，主要由以下几个过程来实现：生长因子与受体结合；受体的酪氨酸激酶(TPK)活性被激活；激活的酪氨酸激酶(TPK)进一步激活其他信号传递体系，如磷酸酯酶C、三磷酸肌醇(IP3)、1，2-二乙酰甘油(DG)、G蛋白、cAMP和蛋白激酶C(PKC)等；磷酸化的蛋白作用于转录因子启动与细胞增殖有关的基因转录；转录出mRNA并合成各种细胞生长繁殖所需要的多肽或蛋白质(图5-6)。1. 结合 生长因子作用的第一步是它必须与细胞膜上的特异受体结合。2. 激活生长因子结合膜上受体后的第一个细胞内反应是受体TPK活性的出现。3. 细胞内信号传递的启动无论细胞外的信号以何种方式进入细胞内，它们都必须将细胞外信号经细胞内的信号传递系统加以传递并引起细胞内的多种蛋白质的活性变化才能最终影响到细胞的生长、增殖、分裂、分化。四、生长因子与肿瘤发生配基 (Lig)生长因子调控细胞的增殖、分化，维持组织和细胞有序的生长发育。如果这种调控失去功能或失去平衡，细胞的增生和分化过程就会出现不协调，由此就可能产生肿瘤。生长因子具有潜在的致癌作用的观念受到了普遍的重视。一般认为，生长因子潜在的致癌作用主要与肿瘤在体内发生和发展中的一些步骤相联系。第一步往往发生在生长因子对细胞的正常生长和分化控制的异常上；第二步是在细胞失常增生基础上继续受到刺激，生长因子分泌水平增高，分化的和未分化的细胞和肿瘤细胞均快速生长；第三步是细胞产生刺激邻近细胞增生的因子，尤其是产生诱导附近血管增生因子，促使肿瘤组织血管化，使肿瘤能够获得足够的营养生长繁殖，并可方便地使肿瘤细胞随血管向作身转移。生长因子参与肿瘤的发生、发展，是其功能的体现。近年来，对生长因子调控异常的研究，发现生长因子对细胞正常生长和分化控制的异常来源于3个方面：一是生长因子分泌的异常；二是正负生长因子的调控异常；三是生长因子及其受体的基因突变。这些研究结果进一步丰富了生长因子潜在的致癌作用的内涵。第七节 肿瘤的发生是多病因、多基因和多阶段肿瘤分子生物学研究的大量事实表明，肿瘤是基因疾病。肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果，在前几节中，已介绍了DNA损伤与与修复、生长因子、癌基因、抑癌基因参与肿瘤发生过程不同侧面的状况，但是肿瘤发生的全过程是一个多基因参与的复杂的演变过程。在某一肿瘤发生的某一阶段，某个基因可能发挥重要作用，但就肿瘤发生的全过程而言，很少由一种基因的作用就能引起肿瘤。由于肿瘤的发生是众多基因参与的结果，所以有人提出了“肿瘤相关基因”的观念。与一个正常细胞转变为肿瘤细胞过程相关的基因(简称参与肿瘤细胞产生的肿瘤相关基因)，主要有代谢基因、修复基因、癌基因、抑癌基因等。而从一个肿瘤细胞发展成肿瘤过程的相关基因(简称参与肿瘤发展的肿瘤相关基因)，主要有肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等，它们在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。然而肿瘤发生和发展这两个过程并不是完全独立存在的，而仅仅是作者叙述的方便。 一、参与肿瘤细胞产生的肿瘤相关基因 从一个正常细胞转变为肿瘤细胞的过程，是一个多基因参与的过程。由于不同的致癌因素，如化学、物理和病毒因素对基因的作用方式不同，参与肿瘤细胞产生的肿瘤相关基因亦不尽相同。 1化学因素致癌过程中的肿瘤相关基因 化学因素致癌过程，主要包括代谢活化、基因损伤、加成物形成、修复失败、癌基因激活、抑癌基因失活、细胞转化、突变细胞产生等阶段。在这些阶段中，有代谢基因、修复基因、癌基因、抑癌基因等基因的共同参与。化学因素致癌过程和参与化学因素致癌的肿瘤相关基因及作用方式，列于图5-9中。 2. 物理因素致癌过程中的肿瘤相关基因物理因素致癌的过程与化学致癌过程不同的是物理致癌因素致癌过程不需要经过代谢活化过程。物理因素可直接损伤DNA，引起DNA断裂、缺失，形成碱基二聚体等。因此，参与物理因素致癌的肿瘤相关基因与参与化学因素致癌的肿瘤相关基因有所不同。物理因素致癌过程和参与物理因素致癌的相关基因及作用方式，列于图5-10中。3.病毒因素致癌过程中的肿瘤相关基因病毒因素致癌过程与化学和物理因素致癌过程相比又有其特殊性，病毒主要靠将其基因整合到细胞DNA中去改变细胞DNA而发挥致癌作用。病毒因素致癌过程，以及参与病毒因素致癌过程中的肿瘤相关基因及作用方式，列于图5-11中。 显然，3种主要致癌因素致癌方式不同，因此，致癌过程中肿瘤相关基因的参与方式亦不相同。但是，它们具有的共性是在癌变过程中都有癌基因和抑癌基因的参与。因此，Whyte、Buhkovich和Horowitz提出：癌基因的活化或抑癌基因的失活是肿瘤产生的前体。二、参与肿瘤发展的肿瘤相关基因无论化学、物理或病毒等致癌因素，都可以使一个正常细胞转变为一个突变细胞，这是肿瘤产生的基因和必备条件。而一个突变细胞是否最终会发展成肿瘤，仍受到诸多因素的制约，在这个过程中仍有多种基因参与。图5-12展示了肿瘤发展过程中肿瘤相关基因的参与。总之，肿瘤的发生与发展是多因素、多阶段、多基因共同参与的结果。就目前的知识和研究成果看，已经发现的肿瘤相关基因主要包括：代谢基因、修复基因、癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等。肿瘤的发生是一个复杂的演变过程，这个过程中还有许多未知数，许多精细的演变阶段及其他肿瘤相关基因都有待不断地去研究、去发现。讨论提纲1. 肿瘤产生的分子基础涉及哪几个方面？2. 主要的癌基因通过哪些途径促癌？3. 抑癌基因抑癌的机制，举例说明。4. 生长因子如何促进肿瘤的发生？其步骤如何？5. 化学、物理和病毒致癌过程的相关基因和步骤如何？6. 如何理解肿瘤的发生和发展是多病因、多基因和多阶段？1. 肿瘤产生的分子基础涉及哪几方面？2. 主要的癌基因通过哪些途径促癌？3. 抑癌基因抑癌的机制，举例说明。4. 生长因子如何促进肿瘤的发生？其步骤如何？5. 化学、物理和病毒致癌过程的相关基因和步骤如何？6. 如何理解肿瘤的发生和发展是多病因、多基因和多阶段？参考文献1. 陈意生, 史景泉主编. 肿瘤分子细胞生物学. 人民军医出版社, 北京, 2002.2. 朱世能, 陆世伦主编. 肿瘤基因理论(第2版). 上海医科大学出版社. 上海, 2000.3. 吴逸明,安王会主编. 基础肿瘤学. 河南医科大学出版社. 郑州, 1998.4. 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