《生物化学实验ⅰ》word版.doc

生物化学实验实验一 糖的制备、定性及含量分析（4课时）一、 实验目的1. 学会糖的制备；2. 利用糖的呈色反应来粗略的定性糖类；3. 糖的含量测定4. 学会使用分光光度计。二、 实验原理还原糖溶于水，非还原糖被酸水解后一般也溶于水，故可用水提取。而原料中的蛋白质可用调PH值的方法除去或用沉淀剂，糖的进一步纯化可采用乙醇沉淀糖。糖的呈色反应有：Molisch反应、Fehling反应、Benedict反诉反应等多种呈色反应。可粗略的定性，较精确则是TCL（单糖，多糖需水解）、GC、HPLC、IR、UV、GC/HPLCMS来定性。本实验用Molisch反应粗略的定性。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、 实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料小麦面粉或罗望子；精密pH试纸。2 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL11（2）大离心管：50mL2（3）烧杯：100mL1（4）三角瓶：100mL1（5）容量瓶：100mL3（6）刻度吸管：1mL1；2mL2；10mL1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）电子天平（11）分光光度计3 试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。（5）6M HCl和6M NaOH各100mL。（6）Molisch试剂：萘酚2g溶于95%乙醇并定容100ml，现配现用（7）冰醋酸、亚硫酸氢钠四、 操作步骤1罗望子多糖的制备工艺流程如下；2罗望子多糖的制备步骤 (1)原料的处理：先将罗望子种子外层红褐色的种皮用机械或化学方法除净，然后用粉碎机将白色的种仁粉碎至60一80目，得到白色的罗望于种仁粉。 (2)煮沸：取10g种仁粉，加入30倍的清水，充分搅拌均匀(为了防止加水后种仁粉结团，可先加入少量水，先将种仁粉调成糊状，然后再加入剩余的水)，用冰醋酸溶液调节pH值，使水溶液的pH值控制在4256之间，搅拌加热至微拂，煮沸20一30min，得到一粘稠的浆状液。 (3)静置沉降；在浆状液中加入原体积50的热水稀释浆状液，搅拌均匀后静置沉淀812h，让浆状液中的蛋白质颗粒等杂质充分沉降。或用离心机离心5min,5000r. (4)分离过滤：将静置沉降后的上清液抽出，下层混思浆状液用离心或压滤的方法分离除去沉降物，合并上清液和滤液，得到乳白色浆液。 (5)浓缩：在乳白色浆液中加入少量NaOH稀溶液，将其PH值回调至中性，再加入少量亚硫酸氢钠溶液漂白，然后加热浓缩至粘稠的半流体状时停止加热。 (6)烘干粉碎，将粘稠的半流体浆倒入白色浅瓷盘中，放入干燥箱中在70一80的温度下进行热风干燥，即得到片状罗望子多糖，最后用粉碎机将片状的罗望子多糖粉碎，即可得到灰白色的粉状罗望子多糖。3、糖的定量（1） 制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540nm）0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。（2） 样品中还原糖和总糖的测定A 还原糖的提取准确称取3.00g罗望子，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4 000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。B 总糖的水解和提取准确称取1.00g罗望子，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。C 制备罗望子多糖的含量测定取上述实验制备的罗望子多糖8mg，加入去离子水10ml。D 显色和比色取5支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）多糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）70.51.51.580.51.51.59111.510111.511111.512111.5 4、糖的鉴定Molisch反应：取（1）、（2）的提取液各1ml,加入2滴molisch试剂、摇匀。倾斜试管加1ml浓硫酸，之后小心坚直。注意不要振摇。在糖溶液与浓硫酸两液间出现紫环，证明有糖的存在。为鉴定糖类最常用的颜色反应五、 结果与计算：计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值及11、12管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。还原糖（%）=查曲线所得葡萄糖毫克数 提取液总体积测定时取用体积100样品毫克数总糖（%）=查曲线所得水解后还原糖毫克数稀释倍数0.9100样品毫克数罗望子多糖（%）=查曲线所得水解后还原糖毫克数稀释倍数0.9100样品毫克数六、附 注1 离心时对称位置的离心管必须配平。2 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。3 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题13,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?2如何正确绘制和使用标准曲线?参考答案1植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。2标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.52cm，标示出刻度和葡萄糖的毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边1.52cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应记在标准曲线上。实验二 糖的硅胶G薄层层析（4课时）一、实验目的：1.理解薄层层析原理，2.掌握薄层层析技术，3.学会糖的较为精确的定性。二、实验原理：硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12一13的石膏，它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层，使不同的物质得以分开使用显色剂显色，得到不同的Rf值。糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄层上的移动速度是戊糖己糖双糖三糖。三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料硅胶G、多糖2主要仪器带密封盖的层析缸、硅胶G板、毛细管、100的烘箱、电吹风机、试管及试管架。3试剂（1）糖标准溶液：木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖10mgm1水溶液。（2）样品液：多糖的水解液。（3）展开剂：乙酸乙酯：乙酸：水2：1：1；氯仿：甲醇60：40(VV)。（4）显色剂：25一50硫酸；二苯胺1g，苯胺1ml和85磷酸5ml溶于50mI丙酮中。 四、操作步骤1将硅胶G板于l00烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样，点样位置为从硅胶板下端15cm、两侧23cm，每个样品点相距1一15cm，斑点直径2mm。点一次吹干一次。2将展层剂于层析缸中平衡。数分钟后，将硅胶板放入。3当展层剂移至距上端23cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂，于100显色。41530min后从烘箱取出，测量Rf值c五、结果与计算：六、思考 1薄层层折与其他层析法比较有哪些优点?实验三氨基酸的薄层层析分离和鉴定（4课时）一、实验目的1理解薄层层析原理，2掌握薄层层析技术，3学会氨基酸的较为精确的定性。二、实验原理薄层层析法是一种检验微量物质的快速准确的分析分离手段。它是将某种吸附剂在一块玻璃板（或硬质塑料板等）上铺成均匀的薄层，把要分离鉴定的样品溶液点在薄层板的一端，在密闭的层析缸内用适宜的溶剂（即展开剂）展开，从而进行层析分析的方法。吸附剂对被吸附化合物的吸附能力有强弱之分，这与吸附剂本身的性质和被吸附化合物的性质是有关的。当被测样品随着展开剂在吸附剂上前进时，由于不同化合物具有不同的结构和性质，展开剂对它们的洗脱力和它们在吸附剂上的吸附、解吸附的性能也就有所不同，因而在吸附剂上移动的距离也就不会相同，这样就达到了分离的目的。在薄层层析中为了获得良好的分离效果必须选择适当的吸附剂和展开剂。吸附剂含水较多时吸附能力就会大为减弱，因此使用吸附剂时一般要先进行加热去水的活化处理。在薄层层析中所用的吸附剂种类很多，用得最广泛的是氧化铝和硅胶。化合物被吸附剂吸附后，要选择适宜的溶剂进行展开。展开剂是一种或两种以上溶剂按一定比例组成的溶剂系统。溶剂的选择通常是根据被测物中各成份的极性、溶解度以及吸附剂活性和分离效果等因素来考虑，否则会影响吸附剂活性和分离效果。观察层析结果时，如果化合物本身有颜色，可直接观察他的斑点。如本身无色，可用显色剂显色。不同物质所用显色剂是不同的。如果被测物质是有机化合物，一般都可采用碘蒸气进行显色。本实验中采用的是茚三酮显色剂。三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料硅胶G、各种氨基酸、酱油等2主要仪器带密封盖的层析缸、载玻片、毛细管、100的烘箱、电吹风机、试管及试管架。3试剂（1）糖标准溶液：甘氨酸、10mgm1水溶液。（2）样品液：调味品的水解液。（3）展开剂：水:乙醇:乙酸 = 1:6:0.5500ml（4）显色剂：溶液：茚三酮O.2g溶于乙醇l00ml中。方法：喷后于110oC加热。结果：呈红紫色斑点。四、实验步骤1薄层板的制备将10g硅胶G和15mL水在小烧杯内迅速混合均匀，再加入5mL水继续搅拌。将调好的糊状物倒在洗净干燥好的玻璃板上，用手摇晃，使其表面均匀光滑，厚度在0.251cm间为宜(我觉得铺板时应加一些粘合剂，因为展开剂中有水，板子比较松散容易掉片。我们用0.3%到0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液铺板。)。在室温下晾干后，置于烘箱内慢慢升温，在105110下活化约半小时。取出后放于干燥器内备用。所配制的硅胶乳状液可制备薄层板35块。2茚三酮显色剂的制备0.2%茚三酮异丙醇溶液3氨基酸的分离和鉴定用毛细管分别取甘氨酸、缬氨酸溶液（各约1.00mg/mL）在薄层板上一端约0.5cm处点样。如在一块板上点二个样，则它们之间必须相隔一定距离；另取甘氨酸和缬氨酸混合溶液（0.5mg/L）点在另一块薄层板上，点样完毕。等斑点干燥后小心地将板置于盛有展开剂（水:乙醇:乙酸 = 1:6:0.5）的层析缸内，点样端浸入展开剂深度约0.3cm为宜。待展开剂上升了10cm以上后，可停止展开。取出薄层板，在前沿线处用大头针轻轻穿刺薄层作出记号。等板晾干后，在110烘箱内干燥大约10分钟，然后用喷雾器均匀地喷上茚三酮显色剂，再放入烘箱内烘烤约15分钟，即可显出各析层斑点。分别测出氨基酸的R f值，并推断它们相互混合时能否进行层析分离。五、结果与计算：Rf=原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离六、附 注1在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄板上层边角；不能对着薄板说话，以防唾液掉在板上。2配制展层剂时，要用纯溶剂，应现用现配，以免放置过久其成分发生变化（酯化）。七、思考题1什么是分配系数？2薄层层析中极性氨基酸与非极性氨基酸展层的速度哪个快一些？3何为“边缘效应”？如何减轻或消除？ 叁考答案1分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在层析条件确定后分配系数是一常数，以K表示。K=固定相中溶质的浓度流动相中溶质的浓度分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。2层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。物质的极性越小（即非极性越大），在有机溶剂中分配就越多，迁移率就越大；反之物质的极性越大，迁移率越小。所以非极性氨基酸在有机溶剂中展层的速度快于极性氨基酸。3在用多元系统进行展层时，其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯仿-甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边易挥发，因此，它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的Rf值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。为减轻或消除边缘效应，可在层析缸的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。 薄层层析法测定调味品中氨基酸含量1样品的预处理 蛋白质是由许多氨基酸分子通过肽键(CONH)缩合而成的。欲测定调味 品蛋白质中氨基酸的组成,首先,必须将蛋白质进行水解。水解的方法有酸性水解、离子交换水解、碱性水解及酶水解等。酸性水解法及离子交换水解法在调味品实际分析过程中使用较多。因为,在强碱性水解条件下,多数氨基酸能被分解,因而碱性水解很少用;酶水解属于一种选择性的部分水解反应,可生成低聚肽类,使用亦受到限制。 对于调味品中的游离氨基酸,根据其易溶于水、难溶于有机溶剂的特性,可用下法进 行提取。 1.1水提 对固体样品,如粉末酱油,必要的话,要粉碎或磨细,用适量水浸泡,最好搅拌12h,过滤,残渣再用适量水反复浸泡二次,过滤,合并水浸液,减压浓缩至1mL(相当于1g样品)。加二倍量甲醇或乙醇以沉淀除去蛋白质、糖类等杂质。过滤,将滤液减压浓缩至小体积。通过强酸性或其它适当的阳离子交换树脂,用1mol/L氢氧化钠溶液或12mol/L氢氧化铵溶液洗脱,收集对茚三酮试剂呈阳性反应的部分,减压浓缩至干,加少量水溶解,留待点样用。 1.2稀乙醇提 固体样品要粉碎或磨细,加适量70%乙醇,加热回流三次(或冷浸三次),每次1 2h,合并三次的乙醇提取液,减压浓缩至小体积,最后应无乙醇存在,然后如上通过离子 交换树脂即得总氨基酸。 2标准溶液与样品溶液的制备 对于调味品中难溶于水的氨基酸,如胱氨酸、酪氨酸,须以0.1mol/L盐酸作溶剂配制。如果应用的标准溶液是盐酸溶液,则样品也必须溶于同样的溶剂中。 对于调味品中易溶于水的氨基酸,不论配制单一的或多种的氨基酸标准溶液,均可用10%正丙醇作溶剂,制备成含每种氨基酸1mg/mL的标准溶液。氨基酸标准溶液通常都是由多种氨基酸配成。此溶液在冰箱或室温可保存24周。 测定多种氨基酸,通常的点样量是0.52L,亦即0.52g氨基酸。欲使薄层上 各种氨基酸分离良好,斑点清晰,关键是要控制标准与样品溶液的点样量。浓度太高,不 仅会出现拖尾现象,还会出现一个氨基酸斑点遮掩另一斑点的现象。含每种氨基酸各 0.5g,点样量为0.5L的0.1mol/L盐酸溶液被认为是薄层的适宜负荷量。 天然样品中各种氨基酸的含量是不一致的,同一样品溶液,薄层的负荷量不同,呈现 的层析谱也会有差异。须防备含量较低的成份被失落,也要避免含量高的氨基酸斑点遮 掩其它斑点。 制备氨基酸有色衍生物进行薄层层析,不需显色便可观察到它们的层析行为。由于 操作复杂,实际上使用较少。3薄层层析2 分离调味品中的氨基酸及其衍生物的薄层一般不需活化,制得的薄层于室温置空气中 干燥过夜即可。氨基酸已在缓冲的或非缓冲溶液的硅胶薄层上取得成功的层析结果。常 用的层析条件是:点样0.52g(含每种氨基酸),再于展开剂饱和的层析槽中(用展开剂润 湿滤纸,环围在层析槽内壁)展开13h,展开距离1015cm,显色剂为水合茚三酮。 BrennerandNiederwieser曾测量过硅胶G薄层上丙氨酸等25种氨基酸的Rf值, 使用了下列六种溶剂系统(溶剂比例均为重量百分比): 96%乙醇水(6337); 正丙醇水(6436); 正丁醇醋酸水(602020);酚水(7525)+20mg氰化钠/100g溶剂; 正丙醇34%氨溶液(6733); 96%乙醇34%氨溶液(7723)。 MutschlerandRochelmeyer报告了赖氨酸等十三种常见氨基酸在磷酸盐缓冲硅胶薄层(pH=6.8)上的Rf值,使用了以下三种溶剂系统: 70%乙醇水溶液; 96%乙醇25%氨溶液(41); 96%乙醇25%氨溶液水(712)。 前二组溶剂系统适用于作双向展开。必须注意的是:在用氨性的溶剂系统展开后,要 将薄层放在100烘箱中加热30min,驱尽氨后,才能喷水合茚三酮显色。 Brener,Niederwieseretal.曾在硅胶薄层上,用双向展开进行过色氨酸等氨基酸混合物层析条件与结果的系统研究,得出十分满意的层析谱。他们使用的溶剂系统是:第一次展开,氯仿甲醇17%氨溶液(221);第二次展开用酚水(31)。点样量是含每种氨基酸0.5g的混合氨基酸溶液。 MoffatandLytle推荐的显色剂是由二种溶液组成:溶液50mL0.2%水合茚三酮在 无水乙醇中+10mL醋酸+2mL2,4,6三甲基吡啶。溶液1%硝酸铜(含三个结晶 水)在无水乙醇中。在薄板喷雾前,将溶液及溶液按503的比例混合。薄板喷雾后,要保持100110的温度。氨基酸的呈色反应是逐渐扩大并加深的,要留意观察。当某些氨 基酸斑点开始呈色时,应立即用笔尖作一记号,这样可以在此斑点被后来逐步扩大并加深 的另外斑点遮掩时,也能被认出。斑点呈红色。不同的氨基酸显色的速度有差别。 Arx氏应用双向展开法在纤维素薄层上将羟脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸 及亮氨酸完全分离开。他们用三块纤维素薄层及四组溶剂系统:这四组溶剂系统是:正丁醇丙酮二乙胺水(1010 25);异丙醇99%甲酸水(40210) 正丁醇丁酮双环已基胺水(101025); 酚水(7525)。层析槽要用3%氢氧化铵溶液饱和。 在三块纤维素薄层上,都用六种氨基酸混合液点一个圆点,三块薄层的第一向均用 溶剂系统展开。此时六种氨基酸分成脯氨酸+甘氨酸+赖氨酸+组氨酸及色氨酸 +亮氨酸两组。然后这三块薄层分别用溶剂系统、及作第二项展开,这样就可将 六种氨基酸完全分开。4常用的薄层及展开剂(见表1)5常用显色剂 薄层层析法鉴别调味品中各种氨基酸所用的显色剂有茚三酮试剂;吲哚醌试剂1,2-萘醌-4-磺酸试剂(Folin);8-羟基喹啉-次溴酸钠试剂(Sakaguchi);碘铂酸试剂;重氮化碘试剂;2,3,5-三苯基H-四唑化氯试剂(TTC试剂);重氮化对氨基苯磺酸试剂(Pauly);蓝光偶氮胺盐试剂(重氮试剂);对二甲氨基苯甲醛-盐酸试剂(Ehrlich试剂);11肉桂醛-盐酸试剂。6定性3众所周知,色谱法本身并不是一种好的定性技术,其所能提供的定性信息惟有保留值。对薄层色谱来说,即Rf值。显然,利用保留值定性,由于色谱分离能力的限制而只能是相对的,所以,薄层色谱定性一般总是利用保留值与化学反应、选择性检测和联用技术相结合进行。在这方面,薄层色谱具有更多灵活性。6.1利用保留值定性 在特定的色谱系统中,化合物的Rf值是一定的,比较未知物和标准物的Rf值,能够鉴定 未知化合物。当然,Rf值的准确测定受到多方面因素的影响。利用相对Rf值,限Rx值进行比较,可以消除一部分因素,改善测定重现性。实践中为了增加通过保留值定性的可靠性,必须改变色谱系统的选择性,重复测定同一化合实验四 粗脂肪的提取、定量及碘值测定（6课时）一、实验目的：1 熟悉植物粗脂肪的经典测定方法和组成成分。2 学习和掌握索氏提取器提取的原理和方法。3 学习和掌握用重量分析法对粗脂肪进行定量测定。4 掌握测定脂肪碘值的原理和操作方法。5 了解测定脂肪碘值的意义。二、实验原理：脂肪广泛存在于许多植物的种子和果实中，测定脂肪的含量，可以作为鉴别其品质优劣的一个指标。脂肪含量的测定有很多方法，如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等。目前国内外普遍采用抽提法，其中索氏抽提法（Soxhlet extractor method）是公认的经典方法。本实验采用索氏抽提法中的残余法，即用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素（Cl2，Br2，I2）进行加成反应。不饱和键数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每100g脂肪所吸收碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。 碘与脂肪的加成反应很慢，而氯及溴与脂肪的加成反应快，但常有取代和氧化等副反应。本实验使用IBr进行碘值的测定，这种试剂稳定，测定的结果接近理论值。溴化碘(IBr)的一部分与油脂的不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸钠滴定。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料油料作物种子、中速滤纸2仪器：（1）索氏脂肪抽提器（图1）或YG-型油分测定器 （2）干燥器(直径1518cm，盛变色硅胶) （3）不锈钢镊子（长20cm） （4）培养皿 （5）分析天平（感量0.001g） （6）称量瓶 （7）恒温水浴 （8）烘箱 （9）样品筛（60目） （10）碘瓶（或带玻璃塞的锥形瓶） （11）棕色、无色滴定管各1支（12）吸量管（13）量筒 3试剂（1）溴化碘溶液取12.2g碘，放入1 500mL锥形瓶内，缓慢加入1 000mL冰乙酸（99.5%），边加边摇，同时略温热，使碘溶解。冷却后，加溴约3mL。 注意：所用冰乙酸不应含有还原性物质。检查方法：取2mL冰乙酸，加少许重铬酸钾及硫酸，若呈绿色，则证明有还原性物质存在。 （2）0.1mol/L标准硫代硫酸钠溶液取结晶硫代硫酸钠50g，溶在经煮沸后冷却的蒸馏水（无CO2存在）中。添加硼砂7.6g或氢氧化钠1.6g（硫代硫酸钠溶液在pH 910时最稳定）。稀释到2 000mL后，用标准0.1mol/L碘酸钾溶液按下法标定： 准确量取0.1mol/L碘酸钾溶液20mL、10碘化钾溶液10mL和1mol/L硫酸20mL，混合均匀。以1淀粉溶液作指示剂，用硫代硫酸钠溶液进行标定。按下面所列反应式计算硫代硫酸钠溶液浓度后，用水稀释至0.1mol/L。 （3）纯四氯化碳（4）1淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）（5）10碘化钾溶液（6）花生油或猪油（7）无水乙醚或低沸点石油醚（A.R.）四、操作步骤1将滤纸切成8cm8cm，叠成一边不封口的纸包，用硬铅笔编写顺序号，按顺序排列在培养皿中。将盛有滤纸包的培养皿移入1052烘箱中干燥2h，取出放入干燥器中，冷却至室温。按顺序将各滤纸包放人同一称量瓶中称重（记作a）、称量时室内相对湿度必须低于70。2包装和干燥在上述已称重的滤纸包中装入3g左右研细的样品，封好包口，放入1052的烘箱中干燥3h，移至干燥器中冷却至室温。按顺序号依次放入称量瓶中称重（记作b）。3抽提将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67倍的无水乙醚，使样品包完全浸没在乙醚中。连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒温水浴中进行抽提，调节水温在7080之间，使冷凝下滴的乙醚成连珠状（120150滴/min或回流7次/h以上），抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止（约需612h）。抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，在通风处使乙醚挥发（抽提室温以1225为宜）。提取瓶中的乙醚另行回收。4称重待乙醚挥发之后，将滤纸包置于1052烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重为止（记作c）。5准确称取上述提取的油0.30.4g 2份，置于两个干燥的碘瓶内，切勿使油粘在瓶颈或壁上。加入10mL四氯化碳，轻轻摇动，使油全部溶解。用滴定管仔细地加入25mL溴化碘溶液，勿使溶液接触瓶颈，塞好瓶塞，在玻璃塞与瓶口之间加数滴10碘化钾溶液封闭缝隙，以免碘的挥发损失。在2030暗处放置30min，并不时轻轻摇动。油吸收的碘量不应超过溴化碘溶液所含之碘量的一半，若瓶内混合物的颜色很浅，表示油用量过多，改称较少量的提取油，重作。 6放置30min后，立刻小心地打开玻璃塞，使塞旁碘化钾溶液流入瓶内，切勿丢失。用新配制的10碘化钾10 mL和蒸馏水50mL把玻璃塞和瓶颈上的液体冲洗入瓶内，混匀。用0.1molL硫代硫酸钠溶液迅速滴定至浅黄色。加入1淀粉溶液约1mL，继续滴定，将近终点时，用力振荡，使碘由四氯化碳全部进入水溶液内。再滴定至蓝色消失为止，即达滴定终点。 另作2份空白对照，除不加油样品外，其余操作同上。滴定后，将废液倒入废液缸内，以便回收四氯化碳。计算碘值。五、结果与计算1粗脂肪的含量：粗脂肪含量（%）=bc100ba式中：a：称量瓶加滤纸包重（g） b：称量瓶加滤纸包和烘干样重（g） c：称量瓶加滤纸包和抽提后烘干残渣重（g）2粗脂肪的碘值：碘值=（AB）T100C式中，A：滴定空白用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数 B：滴定碘化后样品用去的Na2S2O3溶液的平均毫升数 C：样品的重量（g）T：1mL 0.1molL硫代硫酸钠溶液相当的碘的克数六、附 注（1）测定用样品、抽提器、抽提用有机溶剂都需要进行脱水处理。这是因为：第一，抽提体系中有水，会使样品中的水溶性物质溶出，导致测定结果偏高；第二，抽提体系中有水，则抽提溶剂易被水饱和（尤其是乙醚，可饱和约2的水），从而影响抽提效率；第三，样品中有水，抽提溶剂不易渗入细胞组织内部，结果不易将脂肪抽提干净。（2）试样粗细度要适宜。试样粉末过粗，脂肪不易抽提干净；试样粉末过细，则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失，影响测定结果。（3）索氏抽提法测定脂肪最大的不足是耗时过长，如能将样品先回流12次，然后浸泡在溶剂中过夜，次日再继续抽提，则可明显缩短抽提时间。（4）YG-型油分测定器容量大，适合于样品较多的选种鉴定工作使用，温度控制在70左右，8h可提取完毕。（5）必须十分注意乙醚的安全使用。抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。乙醚中不得含有过氧化物，保持抽提室内良好通风，以防燃爆。乙醚中过氧化物的检查方法是：取适量乙醚，加入碘化钾溶液，用力摇动，放置1min，若出现黄色则表明存在过氧化物，应进行处理后方可使用。处理的方法是：将乙醚放入分液漏斗，先以1/5乙醚量的稀KOH溶液洗涤23次，以除去乙醇；然后用盐酸酸化，加入1/5乙醚量的FeSO4或Na2SO3溶液，振摇，静置，分层后弃去下层水溶液，以除去过氧化物；最后用水洗至中性，用无水CaCl2或无水Na2SO4脱水，并进行重蒸馏。 （6）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应不完全。 （7）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试剂不够，必须再添加1015 mL试剂。 （8）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。（9）将近滴定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如震荡不够，CCl4展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使碘进入水层。（10）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。七、思考题1如何利用残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量？2测定过程中为什么需要对样品、抽提器、抽提用有机溶剂都要进行脱水处理？3在实验过程中安全使用乙醚应注意哪些问题？4测定样品粒子粗细有什么要求？5测定碘值有何意义？液体油和固体脂碘值间有何区别？6滴定过程中，淀粉溶液为何不能过早加入？7滴定完毕放置一些时间后，溶液应返回蓝色，否则表示滴定过量，为什么?参考答案1残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量，是用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，来计算粗脂肪含量。2进行脱水处理的原因有三：第一，抽提体系中有水，会使样品中的水溶性物质溶出，导致测定结果偏高；第二，抽提体系中有水，则抽提溶剂易被水饱和（尤其是乙醚，可饱和约2的水），从而影响抽提效率；第三，样品中有水，抽提溶剂不易渗入细胞组织内部，结果不易将脂肪抽提干净。3抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。乙醚中不得含有过氧化物，保持抽提室内良好通风，以防燃爆。4试样粗细度要适宜。试样粉末过粗，脂肪不易抽提干净；试样粉末过细，则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失，影响测定结果。5不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素（Cl2，Br2，I2）进行加成反应不饱和键数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每100g脂肪所吸收碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。因此，液体油的碘值应高于固体脂的碘值。6淀粉溶液不宜加得过早，否则大量的I2与淀粉结合成蓝色物质，这一部分碘就不容易与NaS2O3反应，由碘值计算公式可知，B值减小，因而使滴定值偏高。7这是由于空气氧化I-所引起的。如果溶液未变蓝，说明I-被空气氧化成I2后，继续与Na2S2O3发生反应，而不与淀粉反应生成蓝色，即Na2S2O3过量。实验五 从牛奶中分离奶油、酪蛋白和乳糖（8）牛奶的化学成分很复杂，至少有100多种，主要成分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等组成。一般牛奶的主要化学成分含量为：水分：87.5%脂肪：3.5%蛋白质：3.4%乳糖：4.6%无机盐：0.7%组成人体蛋白质的氨基酸有20种，其中有8种是人体本身不能合成的，这些氨基酸称为必需氨基酸。我们进食的蛋白质中如果包含了所有的必需氨基酸，这种蛋白质便叫作全蛋白。牛奶中的蛋白质便是全蛋白。牛奶中的无机盐也称矿物质。牛奶中含有Ca2+、Mg2+、K+、Fe3+等阳离子和PO43-、SO42-、Cl-等阴离子；此外还有微量元素I、Cu、Zn、Mn等。这些元素绝大部分都对人体发育生长和代谢调节起着重要作用。钙是人体中含量最高的无机盐，是构成骨骼和牙齿的主要成分。人体中90%的钙集中在牙齿和骨骼上。儿童、青少年生长发育需要充足的钙，同样孕妇及成人、中老年人，也需要补充钙质，缺乏钙会影响牙齿和骨骼的正常发育，导致佝偻病。大自然中的钙是以化合态存在的，只有被动、植物吸收后形成具有生物活性的钙，才能更好地被人体所吸收利用。牛奶中含有丰富的活性钙，是人类最好的钙源之一，1升新鲜牛奶所含活性钙约1250毫克，居众多食物之首，约是大米的101倍、瘦牛肉的75倍、瘦猪肉的110倍，它不但含量高，而且牛奶中的乳糖能促进人体肠壁对钙的吸收，吸收率高达98%，从而调节体内钙的代谢，维持血清钙浓度，增进骨骼的钙化。吸收好对于补钙是尤其关键的。故牛奶能补钙这一说法是有其科学道理的。一、实验目的1从牛乳中提取奶油、酪蛋白及乳糖。2对酪蛋白进行纯化。3掌握考马斯亮蓝法测定含量4掌握SDS-PAGE法测定酪蛋白分子量。二、实验原理牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质主要是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径约为20800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。再通过离心而获得的沉淀即为酪蛋白，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳清中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料牛奶、200目的尼龙布 2主要仪器：离心机、离心管、水浴锅、pH计、具塞试管、试管架、烧杯、量筒、微量取样器、分光光度计3试剂：0.2 mol/L HAc-Na buffer、95%乙醇、乙醚、（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000gmL的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。（3）乙醇（4）磷酸（85） 四、操作方法 1奶油的制备：牛奶中的脂肪含量在3438之间，以极微小微明的小球悬浮于乳的液体内，由于比重小，一般都聚集在奶的表层。（1）从牛奶中分离生奶油：取80ml鲜奶，离心后取出上层奶油。奶油放入冰箱。（2）24小时后从冰箱中取出奶油，搅打观察其变化并记录。2酪蛋白的制备： （1）取加热到40脱脂牛奶10mL，倒人50ml离心管中，在搅拌下慢慢加入预热到40、PH46的o2mo1L乙酸乙酸钠缓冲液10mL、用pH试纸或酸度计检验，混合物的最后PH应是47。（2）将上述悬浮液冷却至室温，离心5min(5000rmin)。弃去上清液，得酯蛋白粗制品(沉淀物)。（3）纯化：用水洗沉淀2次；向沉淀中加入20ml左右的水(用玻棒将沉淀充分打碎)，离心5min(5000rmin)，弃去上清液。用乙醇、无水乙醚洗涤沉淀：在沉淀中加入20mL 95乙醇，搅拌片刻(尽可能充分地把沉淀块状打碎)，将全部悬蚀浓转移至布氏漏斗中抽滤。用无水乙醇无水乙醚混合液（等体积）洗沉淀2次，抽干。最后用无水乙醚洗沉淀2次，抽干。 (4)将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。3. 从牛奶中分离乳糖牛奶中的乳糖含量为45，是乳中的特有产物。（1）在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。（2）过滤除去沉淀，在滤液中加入12粒沸石，加热浓缩至35ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。（3）加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。（4） 乳糖成脎试验取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热1015分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。（选做）（5）旋光法测定含量（选做）见资料中nunai 4计算酪蛋白的质量浓度和得率 准确称量从牛奶中分离出的酷蛋白纯品。 (1)计算酪蛋白实际的质量浓度 实际质量浓度以1L，牛奶中酪蛋白的质量(g)表示。 (2)计算得率 酪蛋白得率酪蛋白实际的质量浓度/酪蛋白的理论质量浓度100式中：牛奶中酪蛋白的理论质量浓度为35g/L5酪蛋白纯度测定考马斯亮蓝法1标准曲线制作（1）0100gmL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1 低浓度标准曲线制作管 号1234561 000gmL标准蛋白液（mL）00.020.040.060.080.10蒸馏水（mL）1.000.980.960.940.920.90考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（g）020406080100OD595nm（2）01 000gmL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为01 000gmL的标准曲线。表2 高浓度标准曲线制作管 号7891011121 000gmL标准蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.000.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（g）02004006008001 000OD595nm2样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.51h以充分提取，然后在4 000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（g）。以标准曲线1号试管做空白。表3 待测液蛋白质浓度测定管 号1314蛋白质待测样品提取液（mL）0.10.950.10.95蒸馏水（mL）考马斯亮蓝G-250试剂（mL）OD595nm蛋白质含量（g）6. SDS-PAGE测定酪蛋白分子量见课件SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量五、结果计算X提取液总体积（mL）样品蛋白质含量（g / g鲜重）=测定时取样体积（mL）样品鲜重（g）式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（g）。六、注意事项1、牛奶与缓冲液要预热2、缓冲液要缓加缓搅3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得搅破滤纸4、实验环境要保持空气流通，门窗要开5、酪蛋白等电点随温度不同而变化,等电点pH为4.64.8。分离酪蛋白时,边加醋酸边搅拌,边测pH,同时观察沉淀。开始快搅拌,接近等电点时,应慢搅拌。6、酪蛋白沉淀用200目的尼龙布过滤比较好,同时进行抽滤。用滤纸很难过滤;而用纱布过滤,酪蛋白容易粘在其上。7、用乙醇和乙醚清洗酪蛋白沉淀时,应将酪蛋白捣碎,并在溶剂中搅拌、浸泡,充分洗净脂肪。纯净的酪蛋白应为白色,若发黄表明脂肪未洗干净。七、思考题1.在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调pH到4.8？2.乙醚、乙醇作用是什么？实验六 茶籽油、皂素及蛋白制备及测定（8课时）一、实验目的1从茶籽中提取茶油、茶籽蛋白及茶皂素2对茶籽蛋白进行纯化。3掌握考马斯亮蓝法测定含量4 掌握SDS-PAGE法测定