生物药剂学与药物动力学实验讲义.doc

生物药剂学与药物动力学实验讲义中药药剂学教研室编写2006年12月目 录实验一 片剂溶出度试验 4实验二 尿药法测定水杨酸钠片剂的生物利用度 7实验三 扑热息痛血管外给药的药物动力学研究 10实验四 大鼠在体小肠吸收实验 13实验五 氨茶碱药物动力学的研究 15生物药剂学与药物动力学实验须知生物药剂学与药物动力学属于药物临床应用学科的范畴，具有综合性强、应用性强、创新性强等特点。生物药剂学与药物动力学实验是教学的重要组成部分，是理论与实践结合的主要方式之一。通过实验课不仅能印证、巩固和扩展教学内容，还能训练基本操作技能，培养良好的实验作风。为保证实验课顺利进行，并达到预期的目的，实验中必须做到以下六个方面：1预习实验内容 通过预习，明确实验目的与要求，对实验内容做到心中有数，并能合理安排实验顺序与时间。要明确每个处方中药物与辅料的用途。2遵守实验纪律 不迟到，不早退，不旷课，保持实验肃静，未经许可，不得将实验室物品带离实验室。3重视药剂卫生 进入实验室必须穿整洁的白工作服。先将工作台面擦洗干净再开始做实验。实验过程中应始终注意台面、地面的整洁，各种废弃物应投入指定位置，不能随手乱丢，更不能弃入水槽内。完成实验后，应将容器、仪器清洁，摆放整齐，台面擦净，经教师同意后方能离开。值日生负责整理公用器材，清扫实验室，关好水、电、门、窗。4. 细心操作、勤于思考 称量药品、试剂时，要在称量前（拿取时）、称量时和称量后（放回时）进行三次核对。称量完毕应立即盖好瓶塞，放回原处。对剧毒药品更要仔细核对名称与剂量，并准确称取。实验中要严格控制好实验条件，认真操作每一道工序，以保证成品质量。实验成品应标明名称、规格、配制者、配制时间，并交教师验收。实验中遇到问题应先独立思考，再请教他人。在实验中逐步形成整洁、细致、严谨、冷静、善于观察、善于思考、勤于动手的实验风格。5正确使用仪器、注意安全 使用仪器时要按使用方法正确操作，不熟悉操作方法时，应在教师指导下使用。各种仪器、容器使用时要注意轻拿、轻放，用毕要清洁后放回规定位置。6. 写好实验报告 实验报告是考察学生分析总结实验资料能力和写作能力的重要方面，亦是评定实验成绩的重要依据。实验报告的格式如下所示：【实验目的及原理】写出实验目的及原理。【实验操作】写出具体实验步骤和实验条件。【实验结果】记录各采样时间点及采样的状态，按要求对数据进行处理，并将全班数据进行综合，求其平均值和标准差。【讨论】阐述实验原理、实验收获与教训、建议等。【思考题】回答实验思考题。每一实验内容逐一按以上顺序书写实验报告。实验一 片剂溶出度试验一、实验目的1. 掌握片剂溶出度测定方法及数据处理方法；2. 了解溶出度测定的重要意义及其应用。二、实验提示片剂溶出度是指片剂主药在体外协助适当装置于适宜介质中溶出的速度和程度。测定溶出度的依据是Noyes-Whitney的扩散理论，近年生物药剂学的研究表明，难溶性药物的片剂，崩解时限不能作为判断难溶性药物片剂吸收的指示，因为片剂崩解后的粉粒还不能直接被机体所吸收，溶解是吸收的主要过程，溶解度小于0.11mgmL的药物，其体内吸收常受其溶出速度的影响。溶出速度除与药物的晶型、粒经大小有关外，还与制剂的生产工艺、辅料、储存条件等有关。所以为了控制这些片剂的质量，需测定血药浓度或尿药浓度，对于一些体外溶出度与体内血药浓度有相关性的药物，则可测定其主药成分的体外溶出度作为控制该片剂质量的一项指标。本实验以对乙酰氨基酚片为样品，测定对乙酰氨基酚的溶出度。原理：对乙酰氨基酚在溶出介质中，在257nm波长处有最大吸收，因此可用紫外分光光度法进行测定，测定其在257nm的吸收度（A），用标准曲线方程计算其对应浓度。三、实验内容1. 测出比较法的A值， 用A-W表示，作对照品。 取样品10片，精密称定，计算平均片重W，将称定的片子研细，再精密称取相当于W的量，加约600mL溶出介质（稀盐酸24mL加水至1000mL），水浴（4050）中搅伴溶解，冷至室温，移入1000mL容量瓶中，加入介质至足量，摇匀，过滤，精密吸取滤液1mL置50mL容量瓶中，加入0.04氢氧化钠溶液稀释至50mL，摇匀，照分光光度法（中国药典2005年版二部附录IVA），在257nm的波长处测定吸收度A值，用A-W表示。2. 对乙酰氨基酚片溶出度的测定 A仪器准备 转篮是用40目不锈钢制成的圆筒，高3.66cm，直径2.5cm，顶部通过金属棒连接于变速小马达上。转篮悬吊于盛有溶媒的容器中，距溶出杯底2.5cm，使用前安装就绪，开动电机空转，检查电路是否畅通，有无异常噪音，转篮的转动是否平稳，加热恒温装置及变速装置是否正常，如一切符合要求，就可以开始测定样品。 B. 测定方法 取溶出介质（稀盐酸24mL加水至1000mL）1000mL，加热至37，置溶出杯中，调节转篮转速为100转分，将精密称定重量的药片一片（W）放在转篮内，以溶出介质接触药片时为零时刻开始计时，然后按2、5、10、15、20、30分钟定时取样，取样位置固定在转篮上端液面中间、距离杯壁1cm处，每次取样5mL，将样品液过滤，吸取滤液1mL，余按实验内容1，测出比较法A值项下，自“置50mL容量瓶”始，依法测定规定时间药片溶出的A值，以As 表示。注：（1） 对所用的溶出度测定仪，应预先检查其是否运转正常，并检查温度的控制，转速等是否精确、升降转篮是否灵活等。（2） 溶出方法分转篮法、桨法和小杯法三种。本实验选用转篮法，转篮的尺寸和结构应符合药典规定。（3）每次取出样品液后，应同时补充相同体积的空白溶液。（4） 根据药典规定，应同时测定6片的溶出度，鉴于实验时间限制，每实验组仅要求完成1片的测试。四、测定结果与数据处理1. 每片测定结果记录No.123456取样时间（min）2510152030AsAw累计溶出5Aw=溶出度的计算累计溶出%= ?2. 用普通坐标纸作图求t50 以累计溶出百分比对溶出时间逐一描点,用图估法拟合-平滑曲线,过累计溶出百分比50%处引一与t轴平行的直线,与溶出曲线相交于A,过A点向t轴引垂线交于t1，此t1即为t50，此值供方差分析用。3. 用威布尔分布概率求t50，td和m三个参数 从上面所作溶出曲线所见，累计溶出百分比对相应时间各数据在一般直角坐标纸上作图，并不成直线关系，但可将累计溶出百分比与时间的关系看作统计学上的概率分布函数，用威布尔概率纸使之直线化，从图上即可极为方便的找到t50（溶解50所需时间），td（溶解63.2所需时间）及m（斜率）三个参数，在威布尔概率纸作图的基本步骤如下：A. 以F(t)尺代替累计溶出百分比,t尺为释放时间,用原数据描点,若各点基本上呈直线分布，则可直接拟合一条直线，尤其注意照顾F(t)在30至70范围内的点，使之优先贴近该直线。B. 若各点排布呈曲线状，则沿曲线趋势延伸，与t尺交点的数值作为的初步估计值，以F(t)对t-再作图，若所得各点的排列接近直线，则拟合成直线，若F(t)对t-作图仍为一曲线，则可用类似的方法反复修改，直至作得一直线为止。C. 在F(t)对t（或F(t)对t-）所作图上拟合一直线，有X1和Y轴的交点（称m点）作该直线的平行线，该平行线和Y轴交点在Y尺上投影点的读数即为m值（取绝对值）。D. 所拟合的直线与X轴的交点在t尺上投影点的读数即为m的估计数，本实验中称为td值（溶出63.2所需时间）；与溶出50的交点在t尺上的投影点的读数即为t50。E. 用威布尔概率纸求出t50，td和m三个参数后，可利用方差分析，相关与回归分析的数理统计法来评定同类产品不同批号或不同厂家的片剂质量；另外，还可以评定同一产品体内、体外的相关程度。4. 用溶出参数作方差分析 将两个批号共八片，按本实验方法测得的累计溶出百分比共八组数据，经威布尔概率纸作图得八条直线，由图中求出t50，td和m值，将所得参数列表如下，供方差分析用。参数方差来源自由度离差平方和方差F值显著性t50组间组内合计td组间组内合计m组间组内合计思考题：检查固体制剂的溶出度有何意义？哪些种类的制剂需检查溶出度？实验二 尿药法测定水杨酸钠片剂的生物利用度一、实验目的1. 通过实验掌握用尿药速率法求算体内药动学参数；2. 通过实验掌握药物的生物利用度的一般研究方法；3. 通过测定求出水杨酸钠的生物半衰期。二、实验原理 药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程既有区别，又有联系，具有一定相关性。药物在体内的速度过程变化规律及生物利用度等相关参数的提取，要通过实验采用血药浓度法、尿药浓度法或唾液药物浓度法等方法获得。 在多数情况下，尿药浓度高于血药浓度，定量分析精密度好，测定方法较易建立，且取样方便，可免除受试者多次抽血的痛苦。因此，在体内药物大部分以原型从尿中排出的条件下，通常可用尿药法提取消除速度常数、生物半衰期等动力学参数。 生物利用度反应药物在体内被吸收的速度和程度，它可分为相对生物利用度与绝对生物利用度。当药物的口服制剂与静脉注射剂相比较，可求算绝对生物利用度；与其他制剂相比较，可求算相对生物利用度。本实验采用口服真溶液剂为参比，测定水杨酸钠片剂的相对生物利用度。三、实验方法 1. 绘制水杨酸钠标准曲线 精密称取干燥恒重的水杨酸钠0.5g，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，各精密吸取此溶液1.5、2.5、3.5、4.5、5.5mL分别置50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为0.15、0.25、0.35、0.45、0.55mg/mL的标准溶液。取干燥洁净的带塞玻璃试管5支，分别精密吸取以上各溶液的水杨酸钠标准溶液1mL于试管中，再分别加入Fe(NO3)3试管5mL，混合均匀，用72-100型分光光度计于540nm波长处测定吸收度，将测得数据进行回归分析，得吸收度对标准溶液浓度的回归方程，即为标准直线。参比液以蒸馏水1mL代替标准液。2. 测定生物利用度A. 实验方法I. 选择受试者的条件II. 对受试者的要求a) 服药前48小时开始,不吃任何含水杨酸盐类食物。b) 小便应按规定收集完全，不得损失，并保持尿样不污染。在收集尿样期间内不作剧烈运动。c) 早晨收集空白尿，空腹时口服水杨酸钠片0.6g，对照组口服相当于0.6g的水杨酸钠真溶液。d) 按以下时间喝水和收集尿样，并记录排尿量：服药当天：7：30 喝水 150mL7：55 小便（收空白尿）8：00 用250mL温开水吞服0.3g片的水杨酸钠片两片8：30 收集尿样9：00 收集尿样10：00 收集尿样 喝水200mL12：00 收集尿样 喝水150mL14：00 收集尿样 喝水100mL16：00收集尿样 喝水100mL18：00收集尿样 20：00收集尿样 喝水100mL22：00收集尿样 第二天8：00收集尿样 22：00收集尿样 每次收集尿样的时间必须小便一次，在上一次收集尿样后所排出的小便，均要收集完全，作为下一个时间尿样，每次收尿容器必须洗净，用蒸馏水清洗，沥干备用。III受试者服用样品的安排本实验仅作两种剂型，同一受试者二次服药之间应间隔4天以上。IV测定方法每次尿样测量体积后，精密吸取1mL于干燥洁净的试管中，加Fe(NO3)3试管5mL，按“绘制标准曲线”项下进行测定，参比液用空白尿1mL替代含药尿样，如显色时发现色泽太深，则根据情况将尿样稀释后取样测定（如果气候炎热，须将空白尿及尿样置冰箱中保存，以防长霉发酵，影响结果的准确性。）B. 数据处理I. 将所测各时间尿样的吸收度代入标准直线，计算出该尿样浓度（mg/mL）再乘以尿量（如尿样稀释则需乘上稀释倍数），计算出各时间的尿药排泄量。II. 以lgx/t对相邻两时间的中点时间（t中）作尿药排泄速度曲线。 x : 各时间的尿药排泄量. t: 相邻两次集尿时间的间隔时间.作图:III. 根据作出的尿药排泄曲线求出水杨酸钠片剂和真溶液的动力学参数. 斜率(b)=(Y2-Y1)/( X2-X1) 或将曲线后部直线部分进行回归分析,求出直线斜率b 消除速度常数: k=-2.303b 生物半衰期: t1/2=0.693/k剂型消除速度常数k半衰期(小时)总排泄量(mg)片剂真溶液IV. 生物利用度：以真溶液为参比，求片剂的相对生物利用度 生物利用度（）？V. 尿药法数据记录姓名： 性别： 产品厂家及批号：药量： 服药时间：序号集尿时间（小时）口服水杨酸钠真溶液口服水杨酸钠片尿量（ mL）稀释倍数吸收度平均浓度（mg/mL）排泄量（mg）尿量（mL）稀释倍数吸收度平均浓度（mg/mL）排泄量（mg）1020.53142546678810912101411241238累计累计序号集尿时间（h）中点时间（t中）间隔时间（t）真溶液片剂排泄量(X)平均尿药速度（Xt）Lg(X/t)排泄量(X)平均尿药速度（Xt）Lg(X/t)010.50.250.5210.750.5321.51443256526872710928121129141321024191011383114思考题：血药浓度法与尿药法测定药物动力学参数各有何特点？实验三 扑热息痛血管外给药的药物动力学研究一、实验目的1.通过本实验，掌握生物样品分析方法的基本要求。2.掌握扑热息痛的血药浓度测定方法及有关参数的计算。二、实验原理 扑热息痛与亚硝酸发生亲电取代反应，生成2-亚硝基4乙酰氨基苯酚，用氨基磺酸铵除去过量的亚硝酸，在碱性条件下，2-亚硝基4乙酰氨基苯酚于430nm波长处有最大吸收。三、实验内容1. 标准曲线精密称取扑热息痛100mg，以95乙醇3mL溶解加适量水，转移于100mL容量瓶中，加水至刻度，充分摇匀，得扑热息痛储备液（1mg/mL）,精密吸取储备液2.5mL准确稀释至10mL，得250g/mL的标准液。分别精密吸取250g/mL的标准液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL于离心管中，分别加水使成2mL，各加家兔血浆1.5mL，摇匀，再加入2mL10三氯醋酸，充分混合再离心20分钟（3000rpm）。吸取上清液4mL于25mL带塞刻度试管中，加入1mL6N盐酸，1mL20 NaNO2溶液，摇匀，放置5分钟，使反应完全。慢慢加入2mL15氨基磺酸，振摇至无气泡产生，流水冷却，加入2.5mL20 NaOH摇匀，用2cm比色杯于430nm波长处测定吸收度。用蒸馏水2mL代替标准液同法处理，作空白对照。求出回归方程标准液（mL）0.30.60.91.21.51.8浓度（g/mL）50100150200250300A（3次）A标准曲线（回归方程）2. 回收率试验分别精密吸取250g/mL的标准液0.3、0.9、1.8mL于离心管中各三份，分别加水使成2mL，各加家兔血浆1.5mL，摇匀，以下操作同标准曲线项下“加入2mL10三氯醋酸，充分混合“起，依法操作，测定吸光度，代入回归方程求其浓度，并与加入时浓度相比求出回收率。初始浓度（g/mL）吸光度测得浓度（g/mL）回收率(%)回收率均值RSD(%)21.4364.29128.583. 精密度试验精密吸取250g/mL的标准液0.3、0.9、1.8mL于离心管中各6份，分别加水使成2mL，各加家兔血浆1.5mL，摇匀，以下操作同标准曲线项下“加入2mL10三氯醋酸，充分混合“起，依法操作，测定吸光度，求其日内精密度。初始浓度（g/mL）吸光度吸光度均值RSD(%)21.4364.29128.584.样品稳定性考察将上述标准曲线项下的“0.9mL”样品处理好后于0.5h、1h、2h、3h、4h测定吸收度，考察处理后样品室温放置时的稳定性。时间（h）00.51234吸光度均值RSD(%)5. 样品测定 取家兔5只（雌兔不得怀孕），每只体重2.5 kg3 kg，给药前先从耳静脉取血3mL留作对照。然后按200mg/kg的剂量，肌注给药（给药前禁食12小时）。给药后按第3、5、10、15、25、30、40、60、100、140、180分钟，定时从兔耳静脉取血3 mL，用干燥并带有适量肝素钠的离心管集血，轻轻摇匀，离心10分钟（3000rpm），吸取血浆于干燥试管中，置冰箱中保存备用。取出无药血浆与各时刻的含药血浆，室温解冻后进行测定：吸取1.5mL血浆，置刻度离心管中，加水2mL，混匀，以下操作同标准曲线项下“加入2mL10三氯醋酸，充分混合“起，依法测定吸收度，代入标准曲线，计算出该时刻的血药浓度，以无药血浆按同法处理作对照。6. 结果记录兔子体重： 给药剂量：测定记录：编号1234567891011T(min)35101525304060100140180AAC(g/mL)lgC T(min)C(g/mL)尾段直线相外推线浓度的对数（lgC外推）外推线浓度（C外推）残数浓度（g/mL）C残C外推-C残数浓度的对数lgC残尾段直线相斜率 K残数斜率 ka四、数据处理1. 以血药浓度（g/mL）为纵坐标，时间为横坐标，作吸收曲线图（血药浓度时间曲线）。2. 以血药浓度（g/mL）的对数对时间作血药浓度时间的半对数图，从图中求出消除速度常数K，再用残数法求出吸收速度常数ka。3. 提取参数（t1/2吸收、t1/2消除、tp、Cp）A. 吸收半衰期: t1/2吸收=0.693/kaB. 消除半衰期: t1/2消除=0.693/K C. 血药浓度-时间曲线下的总面积(AUC0-)D. 达峰时间(tp) 根据ka及K求出达峰时间tptp= (lnka-lnK )/(ka-K)=2.303(lgka-lgK)/(ka-K)抛物线拟合法用抛物线C=p+Qt_+Rt2的峰段代替药时曲线的峰段，选取实验数据中最大浓度C（I）左右三点，ti-1, C(I-1), ti, Ci, ti+1, C(I+1)代入，则有：C(I-1)=P+Qti-1=Rt2i-1Ci= P+Qti=Rt2iC(I+1)= P+Qti+1=Rt2i+1 解上述方程组，求得P、Q、R的值抛物线的峰丢按横坐标（峰时）为tp=-Q/2RE. 峰浓度CpCp=A(e-Ktp- e-Katp)A-截距(可以从lgCt图中求得)实验结果:思考题：血药浓度法求算药物动力学参数的原理？血药浓度法测定药物动力学参数的要求？实验四 大鼠在体小肠吸收实验一、实验目的1.掌握大鼠在体小肠吸收的实验方法。2.掌握计算药物的吸收速度常数（Ka），以及每小时吸收率的计算方法。二、实验原理大多数药物以被动扩散方式从生物膜的高浓度侧通过膜向低浓度侧转运。被动扩散可用Fick第一定律来描述。该定律指出，扩散速度（dC/dt）正比于膜两侧的浓度差（C）,因此有：（1）式中C是消化道中的药物浓度，Cb是血液中药物浓度，Ka是吸收速度常数，其值大小取决于药物的扩散常数、吸收膜的厚度与面积以及药物对膜的穿透性。胃肠道吸收的生物学过程包括这样一个系统，即药物从胃肠道屏障的一侧向另一侧扩散。因为进入血液的药物很快分布到全身，故与吸收部位比较，血中药物浓度维持在很低的水平。几乎在所有口服给药的情况下，对于胃肠道来说，血液的作用犹如“水槽”。并且在整个吸收相保持很大的浓度梯度，CCb，则CC，于是（1）式可以简化为：（2）此为一级速度方程式的标准形式。胃肠道按一级动力学从消化液中吸收大多数药物。用消化液中药物量的变化）dXa/dt)表示吸收速度，则： (3)将（3）式积分，并在方程两侧同取对数。（4）式中Xa为消化液中药物量，Xa(0)为零时刻消化液中药物量，Ka为药物吸收速度常数。以lnXa对t作图得一条直线，其斜率为药物在小肠中的吸收速度常数（Ka）。三、实验内容1. 实验操作（1） 取85ml供试液（100mlKrobs-Ringer试液含SD2mg, 酚红2mg）加入循环装置中。（2） 将实验前禁食一夜，体重200g左右的雄性大鼠，称重，腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为100g体重注射0.4ml），麻醉后并加以固定。（3） 沿腹中线打开腹腔。自十二指肠上部及回肠下部各剪开一个小口，各插入直径为0.5cm的玻璃管，用线扎紧，并用37的生理盐水将小肠内容物冲洗干净，然后将大鼠串联到循环装置中。（4） 开动蠕动泵，以5ml/分的流速循环10分钟后流速调至2.5ml/分。（5） 自烧瓶中取样1.5ml（1ml、0.5ml各一份）为和酚红零时间样品，并补加2ml酚红溶液（每毫升Krobs-Ringer试液含酚红20g），其后每15分钟取样（1ml、0.5ml各一份），同时补加酚红溶液2ml。由于酚红不被小肠吸收，用以测定水被小肠吸收的量。2. 定量方法（1）磺胺嘧啶的定量取样品1ml，加入1mol/L 5ml,加入0.1%NaNO2 1ml, 摇匀，放置3分钟，加入0.5氨基磺酸氨1ml，摇匀，放置3分钟。加入0.1萘乙二胺2ml，摇匀，放置20分钟。在波长555nm处测定吸收度。参比溶液的配制：取1ml供试液按磺胺嘧啶的定量方法不加萘乙二胺显色剂。（2） 酚红定量取酚红溶液0.5ml，加入0.2mol/L NaOH 5ml，摇匀，在波长555nm处测定吸收度。参比溶液：0.2mol/L NaOH溶液。3标准曲线的制备（1）酚红的标准曲线精密称取酚红100mg，置1000ml容量瓶内，加1Na2CO3溶液溶解并稀释至刻度，制成100g/ml的储备液。取1，2，3，4，5，6ml的储备液于10ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。自上述各溶液中吸取0.5ml，按酚红的定量方法测定吸收度，并绘制标准曲线。（2）磺胺嘧啶标准曲线精密称取磺胺嘧啶标准品10mg置100ml容量瓶中，以蒸馏水溶解并稀释至刻度，使成100g/ml的储备液。取储备液适量，稀释成20100g/ml的溶液，分别吸取2，4，6，8，10ml于10ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。从上述溶液中吸取1ml按磺胺嘧啶定量方法测定吸收度，并绘制标准曲线。四、数据处理1 将实验数据按表1中公式进行计算。表1大鼠在体小肠吸收量的计算式取样时间（h）SD吸收度SD浓度酚红吸收度酚红浓度供试液体积剩余药量循环前A0C0A0C0V0=85mlP0=85C00A1C1A1C10.25A2C2A2C20.5A3C3A3C3.tnAnCnAnCn2. 以剩余药量的对数对时间作图，求出吸收速度常数Ka和每小时吸收率（）。每小时吸收率（）（零时间剩余药量60分钟剩余药量）/零时间剩余药量100思考题：用小肠剩余药量测定吸收速率常数的原理？实验五 氨茶碱药物动力学的研究一、实验目的1.掌握紫外分光光度法测定氨茶碱的血药浓度，求算有关药动学参数二、实验原理由于氨茶碱有效血药浓度范围较窄，一般为1020g/ml，故有必要进行临床监测。在酸性条件下，血清中的茶碱可用有机溶媒萃取出，并同时沉淀血清蛋白，再用碱夜把茶碱自有机溶媒中萃取出，然后进行紫外测定，采用双波长测定法，分别测定在波长274nm和298nm处的吸收度。三、实验内容1. 氨茶碱标准曲线的绘制：取氨茶碱标准品，精密称量以0.1mol/L NaOH溶液配成500mg/L的贮备液。另取试管5只，各加入0.5ml空白血清，然后依次加入上述贮备液4.0l、8.0l、12l、16l、20l，各加入0.1mol/L NaOH溶液至4.0ml，其浓度分别为0.5g/ml、1.0g/ml、1.5g/ml、2.0g/ml、2.5g/ml的标准液。按血药浓度测定法处理，用紫外分光光度计在波长274nm及波长298nm处测定吸收度（0.1mol/L NaOH溶液作参比）。2. 血药浓度的测定：取血清样品0.5ml置试管中，加0.1mol/L盐酸溶液0.2ml，5异丙醇氯仿液5ml，振摇混合，离心（2500r/min）10min。吸取氯仿液（上层）4.0ml置于另一试管中，加入0.1mol/L NaOH溶液4.0ml，混匀，离心10min，吸取碱液（上层）33.5ml，用紫外分光光度计，测定碱液在波长274nm和波长298nm处的吸收度。3. 药动学实验设计：选用雄性家兔称重，按10mg/kg剂量给药，以5葡萄糖溶液稀释氨茶碱注射剂10倍，由耳静脉给药（2min内注完）。然后分别于0.25h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h取血约2ml（另一耳静脉取血）。分离血清（试管不涂肝素，静置，离心2000rpm），备用。依法测定血药浓度。四、实验结果1.绘制标注曲线根据测定的吸收度计算A，即AA274-A298。列表，求出标准曲线回归方程。表1氨茶碱标准曲线数据试管号12345C(g/ml)A274A298A回归方程2. 将测定的血药浓度测定数据填于表2，根据标准曲线计算样品的血药浓度。表2血清样品中氨茶碱浓度0.250.51.01.523468T(h)A274A298AC(g/ml)3. 将表2中数据以半对数作图，得到血药浓度时间图。按二室模型处理方法，求出、A、B等参数。思考题：做好本次实验的关键是什么？在操作中应注意哪些问题？