Westernblotting 技术 实验室专用.doc

Western blotting1. 总蛋白的提取a) 收集小鼠组织或是细胞入1.5 ml离心管中。b) 每管加一定量的蛋白裂解液。注：蛋白裂解液的多少以最后能得到的蛋白浓度达到10 g/l左右为佳。c) 用匀浆棒进行匀浆（冰中进行）。d) 加入一定量的PMSF，使其终浓度为1 mM。e) 冰中放置3060 min。 f) 4、12000 rpm离心30 min，上清即为总蛋白。可放-30保存待用。2. 蛋白浓度的测定（BCA试剂盒）A. 标准曲线的制作a) 配不同浓度的标准液（见表2-1）表2-1 BSA各浓度标准液的配制Table 2.1 Preparation of standard solution with different BSA concentration10 mM Tris-HCl （pH=7.5）Final BSA ConcentrationA700 l100 l BSA250 g/lB400 l400 l A液125 g/lC450 l300 l B液50 g/lD400 l400 l C液25 g/lE400 l100 l D液5 g/lF400 l0 g/lb) 按50：1配Solution A：Solution B混合液，每个样本需2 ml。c) 在每个试管中加入2 ml Solution A：Solution B混合液以及0.1 ml 样本，于60水浴30 min。d) 测OD562nm，空白对照为10 mM Tris-HCl （pH=7.5），绘制标准曲线。B. 测样品浓度a) 用10 mM Tris-HCl（pH=7.5）稀释样品100倍。b) 加2 ml Solution A：Solution B混合液 + 0.1 ml稀释样本，60水浴 30 min。c) 测OD562nm。调出标准曲线，读出对应浓度值，再乘以100，即为该样品浓度。3. SDS-PAGE电泳A. PAGE胶的制备（5%浓缩胶、10%分离胶）。a) 10%分离胶溶液的配制30% Acr-Bis（29：1）1.32 ml1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)1 ml20% SDS20 l加水至4 ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入20 l的10%过硫酸铵（APS）以及2 l的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间（液面最高处应在梳子下方约0.5 cm处）。然后缓慢加入1 ml去离子水，37放置30 min。待胶凝固，吸干胶上面的水。b) 5%浓缩胶溶液的配制30% Acr-Bis（29：1）0.34 ml0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)0.5 ml20% SDS10 l加水至2 ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入10 l的10% APS以及2 l的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间分离胶的上方，加满，插入梳子。室温放置待其凝固。B. 蛋白样本制备取20100 g的总蛋白，加入同样体积的2蛋白上样缓冲液，于沸水中煮5 min，然后6000 rmp、2 min，取上清待用。C. 电泳a) 把做好的浓缩-分离胶板放入电泳装置中，加入1蛋白电泳缓冲液，轻轻拔出梳子。b) 把蛋白样本加入加样孔。c) 电泳：浓缩胶70 V，分离胶140 V，直至溴酚蓝迁移至底部，停止电泳。D. 电转膜a) 准备好与胶大小一致的硝酸纤维素膜一张、两张相应大小的滤纸，将其与纤维垫放入1蛋白转膜缓冲液中浸泡1560 min。b) 按照纤维垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维垫的顺序作好转膜三明治，滤纸、胶、膜、滤纸各层中要用玻棒赶尽气泡，然后放入转膜装置中。注意放置的次序：负极（黑孔板）纤维垫 滤纸 胶 膜滤纸 纤维垫 正极（红孔板）。c) 于4、100 V转膜12 h。d) 转膜完毕后，取出膜，放入丽春红染液中染色5 min，观察转膜效果。e) 将膜于清水中冲洗，洗去丽春红，放入PBS，待用。E. 封闭将膜放入5%脱脂奶粉（PBS配制）中，于脱色摇床中室温缓慢摇1 h。F. 杂交a) 用PBS或是封闭液稀释一抗：Rabbit-anti-Dnaic2（1：2）、Rabbit-anti-DNAI2（1：1000）、Mouse-anti-myc（1：1000）、Mouse-anti-tublin（1：1000）、Mouse-anti-Stat3（1：100）、Rabbit-anti-p-Stat3（1：100）或是Mouse-anti-PCNA（1：100），于37摇23 h或是4摇过夜。b) 用含1% Tween-20的PBS洗膜两次，每次5 min。c) 加入用PBS或是封闭液稀释的相应的二抗：HRP-Goat-anti-Mouse IgG（1：1000） 、HRP-Goat-anti-Mouse IgG（1：2000），于37摇1 h。G. ECL显色（ECL显色试剂盒） a) A液：B液=1：1混合，加到膜上，封好。b) 压片曝光15 min。4. 显影、定影，用水冲洗胶片、晾干。1. 蛋白裂解贮存液：1M Tris-HCl (pH=7.5)5 mlTriton X-1001 ml0.5M EDTA (pH=8.0)1 ml加水至100 ml，用滤纸过滤，4保存。用时加入leupeptin（终浓度为10 g/ml）及aprotinin（终浓度为10 g/ml）蛋白酶抑制剂配成蛋白裂解液。2. 100 mM PMSF：PMSF17.42 mg加无水乙醇至1 ml，-20保存。3. 1.5 M Tris-HCl（pH=8.8）:Tris碱90.8 g去离子水400 ml溶解后，加浓盐酸调pH至8.8，然后定容至500 ml。4. 0.5 M Tris-HCl（pH=6.8）:Tris碱30.3 g去离子水400 ml溶解后，加浓盐酸调pH至6.8，然后定容至500 ml。5. 10% APS：APS0.1 g加去离子水至1 ml，现配现用。6. 2蛋白上样缓冲液：0.5 M Tris-HCl (pH=6.8)1.25 ml甘油2.5 ml20% SDS1 ml0.5% 溴酚蓝0.2 ml加去离子水至10 ml，-30保存。使用前加入-巯基乙醇（终浓度为5%）。7. 10蛋白电泳缓冲液：Tris碱30.3 g甘氨酸144 gSDS 1% w/v加去离子水至1 L。使用时稀释成1电泳缓冲液。8. 1蛋白转膜缓冲液：Tris碱3.03 g甘氨酸14.4 g甲醇200 ml加去离子水至1 L，现配现用。9. 丽春红染液：丽春红0.5 g冰乙酸1 ml加去离子水至100 ml。10. 5%脱脂奶粉：脱脂奶粉2.5 g加PBS至50 ml，现配现用。