齐鲁细胞AIL细胞治疗手册.doc

肿瘤细胞免疫治疗重大事件1893年，“coley毒素”疗法，采用杀死的化脓性链球菌及灵杆菌滤液治疗癌症病人。1950年，卡介苗（BCG）疗法用于治疗膀胱癌。1970年，大剂量细胞因子（IL-2）用于黑色素瘤和肾癌的治疗。1980年，淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK细胞）用于治疗黑色素瘤和白血病。1990年，细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）用于各种肿瘤的治疗，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL细胞）用于黑色素瘤的治疗。2000年，国际著名医学杂志柳叶刀发表了扩增活化的自体淋巴细胞（AIL）有效降低肝癌患者术后复发的临床随机对照实验结果，将复发危险率降低41%。21世纪初，日本开始应用AIL细胞技术作为肿瘤治疗的辅助手段，至2010年，每年医治患者约10000例，该方法在多种实体瘤的治疗中显示出疗效。2007年，韩国FDA批准AIL细胞进入肝癌治疗的IV期临床实验，神经胶质母细胞瘤的III期临床试验。2010年，美国食品和药物管理局（FDA）批准了免疫细胞用于前列腺癌的治疗。目录AIL细胞治疗说明31 AIL细胞的定义32 AIL细胞的疗效32.1体外32.2动物52.3临床63 AIL细胞和CIK治疗的区别83.1AIL细胞的主要细胞成分83.2AIL细胞治疗效果经过临床随机对照验证93.3 AIL细胞的技术优势103.4 AIL细胞的临床应用优势104 AIL细胞可能出现副作用及其处理105 AIL细胞的适用证和禁忌症115.1患者选择标准115.2 AIL细胞的适用证115.3 AIL细胞的禁忌症116 AIL细胞的治疗方案126.1配合手术使用126.2配合化疗使用126.3配合放疗使用126.4与靶向药物联合使用126.5单独使用126.6综合治疗127 采血及注意事项14 7.1采血前工作14 7.2采血用具的准备158 回输及注意事项16 8.1回输日期的通知和确认16 8.2AIL细胞的包装和质量检验单16 8.3AIL细胞的运输16 8.4AIL细胞的回输169 其他注意事项18 9.1知情同意书18 9.2回输方案的制定18 9.3血液、细胞的储存及运输要求18附件 AIL细胞治疗采血操作规程18AIL细胞治疗说明1 AIL细胞的定义扩增活化的自体淋巴细胞（Autologous Immunotherapy Lymphocytes，AIL），又称为自体强效CIK细胞，是从患者自体外周血（50-100ml）中分离单个核细胞，经过体外激活扩增培养，得到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细胞的细胞群，主要效应细胞包括MHC限制性效应细胞（CD3+CD8+ 细胞毒性T细胞、CD3+CD4+ 辅助性T细胞）、非MHC限制性效应细胞（CD3+CD56+ NKT细胞、CD3-CD56+ NK细胞），可有效辅助恶性肿瘤的治疗。2 AIL细胞的疗效2.1体外2.1.1 AIL细胞对自体肿瘤细胞具有直接杀伤作用采用来源于非小细胞肺癌患者术后的肿瘤组织进行体外原代培养，同时培养其自体AIL细胞。用ELISPOT方法检测AIL细胞对自体肿瘤细胞的杀伤作用。5例自体肿瘤组织中有3例肿瘤细胞在体外生长。未经传代培养的肿瘤细胞作为AIL细胞的自体靶细胞。AIL细胞在体外与自体肿瘤细胞共培养后，可检测到所分泌的杀伤性细胞因子IFN-产生，而不加靶细胞的效应细胞几乎没有IFN-的产生。在肿瘤数量一定的情况下，AIL细胞的数量与IFN-的产生成正比（图1）。图1 三例非小细胞肺癌患者AIL细胞对自体肿瘤细胞的作用（ELISPOT：检测的细胞因子：IFN-）。1-3例：AIL细胞对照；4-6例：分别为AIL细胞：自体肿瘤细胞效靶比为10:1、5:1、1:1时，AIL细胞所释放的IFN-。2.1.2 AIL细胞中肿瘤抗原特异杀伤性T淋巴细胞的比例明显升高经过AIL细胞方法培养后，所检测的三例供者的AIL细胞中肿瘤抗原特异性的CD8+ T细胞与未经培养的PBMC相比，其频数均有不同程度的增加（表1）。由于AIL细胞经过扩增后细胞量至少可达到11010，因此，扩增后肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的数量增长可达至几千至几万倍，数量可达8107至3.2109，从而发挥特异性抗瘤作用。细胞表面分子 培养前的百分比（均值） 培养后的百分比（均值） CD3 65.0 83.7 CD4 33.2 10.6 CD8 22.8 63.0 CD4/CD8 1.9 0.2 CD3+CD56+ 5.4 11.7 CD3-CD16+ 12.6 11.8 CD4+CD25+ 3.3 1.7 2.2 动物为了验证AIL细胞对肝细胞癌的抗癌效果，我们选择了使用肝癌细胞细胞系HepG2成瘤的裸鼠作为动物模型，通过注射AIL细胞，观察AIL细胞对肝癌细胞HepG2移植瘤的抗肿瘤效果。动物实验结果显示，在HepG2移植瘤裸鼠成瘤的过程，使用AIL细胞治疗的裸鼠移植瘤的体积和重量均明显低于对照组，且随着使用淋巴细胞数量的增多，杀伤肿瘤效果相应增强（表2）。组别 注射渠道 注射剂量 (细胞数/只) 注射液量 (ml) 每组裸鼠数量 (个体号) 每组肿瘤平均体积（mm3）每组肿瘤平均重量（g） G1 阴性对照组 微静脉 0 0.3 10 (1M01 1M10) 1444.69 0.96 G2 低剂量组 微静脉 1.7 105 0.3 10 (2M11 2M20) 1236.45 0.82 G3 中剂量组 微静脉 5 105 0.3 10 (3M21 3M30) 979.91 0.73 G4 高剂量组 微静脉 15 105 0.3 10 (4M31 4M40) 941.39 0.72 G5 阳性对照组 腹腔 2 mg/kg 10 ml/kg 10 (4M41 4M50) 847.920.64 2.3 临床2.3.1 预防肝癌术后复发AIL细胞治疗恶性肿瘤的随机临床试验表明，使用细胞免疫治疗可提高患者的无复发存活率：经过免疫治疗的肝癌术后患者，与不经过治疗的对照组相比，肝癌术后复发的危险率降低了41%The Lancet, 2000, 356: 802-807.（表3，图2）。術後复发 期間 免疫群（76例）（） 対照群（74例） 値（） 5年以内复发 45(59%) 57(77%) 0.01 2年以内复发 25(33%) 40(54%) 0.005 2.3.2 联合常规放化疗明显提高神经胶质母细胞瘤患者生存期在日本进行的临床试验中发，AIL细胞治疗与常规治疗联合使用可以明显延长部分患者的生存期（表4）。2.3.3 AIL细胞治疗显著改善患者免疫功能在19例已出现转移的晚期恶性肿瘤患者，应用AIL细胞治疗后的两到四周后，患者外周血中CD3+CD8+和CD3+CD56+亚群比例均比输注AIL细胞前显著提高，同时还检测到IFN-分泌细胞数量也明显增加，其中CD3+IFN-+和CD3- IFN-+淋巴细胞与回输前相比均有显著性意义增加，P值分别为0.0060和0.0145。更进一步的结果表明，回输AIL细胞后，CD3+CD8+和CD3-细胞亚群中IFN-分泌细胞的比例均有显著提高，这表明AIL细胞治疗有可以提高外周血中具有抗肿瘤作用的细胞毒性T淋巴细胞数量的能力（图3）。3 AIL细胞和CIK治疗的区别AIL细胞本质是高效CIK细胞。它们在培养的目标细胞，体外培养方法，临床操作方法等方面有共同点也有区别。近年来，免疫学和细胞生物学在许多关键课题上有了重大突破，AIL细胞技术利用了这些新的技术，在细胞筛选、培养等方面进行了优化和改进，其区别如下：3.1 AIL细胞增殖效率在特定细胞因子作用下，AIL细胞的增殖速度快，增殖倍数高，与CIK相比有明显差异（图4）。AIL细胞的主要成分与CIK基本相同（图5），在总体细胞数量多的前提下，AIL的效应细胞的绝对数量相对较高，在相同效靶比下AIL对K562细胞的杀伤活性高于CIK（图6）。图4 AIL与CIK增殖倍数图5 CIK与AIL细胞表型图6 AIL与CIK体外对K562细胞杀伤效率3.2 AIL细胞的技术优势3.2.1 无血清培养体系AIL细胞体外培养体系采用独特的无血清培养基和细胞因子组合。无血清培养系统避免了使用血清可能导致的细胞污染及其它对细胞生长的不利因素。所采用的细胞因子均为药用级别。3.2.2 细胞扩增效率高，不需要使用单核细胞采集机在体外高效活化和扩增患者自身的T淋巴细胞，从1-2107外周血单个核细胞开始，可以获得3-20109活化扩增的以杀伤性T淋巴细胞和NKT 细胞为主的混合细胞群体，这种高效扩增，避免了需要使用大量起始外周血单个核细胞对患者整体免疫细胞系统的破坏作用。3.2.3 细胞活性高、稳定性好使用AIL细胞培养体系产出的细胞，活性和稳定性好，细胞可保存12小时而不影响其治疗效果。3.3 AIL的临床应用优势AIL细胞的种子细胞在冻存后依然可以扩增到1*1010的数量级，因此，单次采血可以满足多个疗程的细胞回输，而且细胞回输的时间可根据放化疗等治疗手段的周期进行调整，有效配合放化疗等，达到最好的治疗效果。4 AIL细胞可能出现的副作用及其处理方法AIL细胞治疗可能出现的副作用如下：反应免疫治疗组 (n=76)*细胞回输次数 (n=370)发热36 (47%)50 (14%)头痛3 (4%)5 (1%)恶心3 (4%)4 (1%)头晕1 (1%)1 (03%)搔痒1 (1%)1 (03%)心动过速1 (1%)1 (03%)总体45 (59%)62 (17%)副作用以发热为主，常常出现在治疗后4-8小时，体温一般38左右，发热在2-4小时内可缓解，不需特殊处理，对体温超过38.5的患者，可用退烧药解除症状，其他症状对症处理。5 AIL细胞的适应症和禁忌症5.1 患者选择标准1） 确诊为恶性肿瘤；2） 生活自理，卡氏体力状况评分标准60分以上；3） 预期生存期3个月的患者；4） 实验室检查必须符合下列条件：淋巴细胞绝对值0.8*109/L，血小板50*109/L，血红蛋白70g/L；5） 病人有自知能力，能签署知情或者志愿同意书；6） 通过手术或其他方式能够获得一定数量的肿瘤组织的患者可以制备肿瘤特异性DC细胞进行治疗。5.2 AIL细胞的适用症1）各种免疫原性较强的肿瘤，如：肺癌、肝癌、结直肠癌、肾癌、恶性黑色素瘤等； 2） 原发灶去除后（手术、放疗等），免疫力低下，恢复慢，预防肿瘤复发。如胃癌术后、肺癌术后、肝癌术后等； 3） 肿瘤广泛转移，无法进行手术者，可与化疗配合使用； 4） 对放化疗不敏感或者无法耐受的肿瘤患者； 5） 常规治疗后（手术及放化疗）需要提高身体免疫力者； 6） 肿瘤临床康复后的肿瘤复发预防。5.3 AIL细胞的禁忌症1） 脏器移植者不适用；2） T细胞淋巴瘤、T细胞白血病，由于本身即是免疫细胞的病变，所以亦不适用；3） 严重的自身免疫性疾病者；4） 不可控制的感染性疾病；5） 对细胞培养过程中所用生物制剂过敏者；6） 怀孕或哺乳期妇女；7） 器官功能衰竭者，具体器官标准如下： 心脏：IV级以上 肝脏：达到国内肝功能分级C级以上 肾脏：肾功能衰竭及尿毒症 肺：出现严重的呼吸衰竭症状，累及到其他脏器，如肝、肾功能 脑：脑转移并伴意识障碍者6 AIL细胞的治疗方案6.1 配合手术使用 术前采血培养，术后第7天回输，提高免疫力，机体恢复快，清除残留肿瘤细胞和组织，防止复发和转移。6.2配合化疗使用 化疗前采血培养，细胞培养期间进行一次低剂量化疗，化疗疗程结束后第3-7天回输（可根据化疗药物的半衰期调整，一般化疗药物半衰期过后回输，免疫细胞回输完后，间隔至少7天再进行下个疗程的化疗），提高机体免疫力，降低药物毒副作用，进一步抑制或杀伤癌细胞。6.3配合放疗使用 放疗前采血，放疗疗程间歇期回输（例如，周五放疗后给细胞，周一开始放疗），或采血后冻存种子细胞，待放疗疗程结束后回输免疫细胞（放疗结束后当天即可回输免疫细胞，免疫细胞回输完后，间隔至少7天再进行下个疗程的放疗），提高机体免疫力，提高化疗敏感性，降低放疗毒副作用，进一步抑制或杀伤癌细胞。6.4与靶向药物联合使用 提前采血，靶向药物使用后的第2天回输，如使用靶向药物为单抗，可利用ADCC效应杀伤肿瘤细胞。6.5单独使用 采血培养，14天左右回输，首次使用最好连续回输两个周期。6.6综合治疗手术、放化疗、微创治疗、靶向药物治疗、免疫细胞治疗等治疗手段的联合治疗，首先手术，然后采用放化疗、微创治疗、靶向治疗等手段降低肿瘤负荷，肿瘤负荷降低后回输免疫细胞杀伤残留肿瘤细胞，起到防止复发和转移的作用。7 采血及注意事项7.1 采血前工作7.1.1 抽血前检查1）进行患者筛查：包括乙肝、丙肝、艾滋病毒、梅毒等感染。极晚期患者需进行血培养检查，以排除患者患菌血症。（艾滋病阳性患者不能进行细胞培养；菌血症患者不能进行细胞培养）。患者需提供以下检查结果：a） 血常规（患者未经其他治疗时，7天内有效），此结果必须提供；b） 感染筛查（患者未经其他治疗时，30天内有效），此结果必须提供；c） 肿瘤标志物（患者未经其他治疗时，30天内有效），此结果建议提供；以进行治疗评价；d） CT或X光片、B超（患者未经其他治疗时，30天内有效），此结果建议提供，以进行治疗评价；e） 病毒拷贝数检测（患者未经其他治疗时，7天内有效），对慢性病毒感染患者，此结果建议提供，以进行治疗评价；f） 血生化全项（患者未经其他治疗时，7天内有效），此结果建议提供；以进行治疗评价。2）检查患者血常规，根据淋巴细胞比例和淋巴细胞绝对值决定患者抽血量。抽血量（mL）=（80淋巴细胞绝对值）109（计算取血量超过100mL原则上不能进行细胞培养）注：淋巴细胞绝对值=人外周血白细胞数人外周血淋巴细胞百分数健康人外周血淋巴细胞绝对值正常范围：0.8-4109/L健康人外周血淋巴细胞百分数正常范围：0.2-0.4（20%-40%）健康人外周血白细胞数正常范围：4-10109/L3）肿瘤患者抽血前没有任何感染、发热（肿瘤热除外）以及心、肝、肺、肾功能异常。7.1.2患者填写知情同意书由医生据患者病情提出AIL细胞治疗并填写患者信息表，患者签署知情同意书。7.1.3 医生提供其它治疗安排a） 目前无其它治疗；b） 手术时间安排；c） 化疗时间安排；d） 放疗时间安排；e） 靶向治疗时间安排；f） 抗病毒治疗时间安排。7.1.4 采血时间的确认医生结合实验室检查结果和临床安排确认采血时间并通知业务人员（最好根据手术、放化疗的疗程同时制定好回输计划及采血时间）。7.1.5患者缴费主管医生收到患者缴费相应单据后安排人员进行采血操作。7.1.6 病人采血前注意事项a） 尽量空腹抽血，若抽血时间较晚也可适当进食，但勿食用油腻食物或进食过量，且最好在进食2-3小时后抽血；b） 抽血前不能输液；c） 手术病人应术前取血；化疗病人应在化疗疗程开始前取血或化疗后血象恢复正常后取血；放疗病人应在放疗疗程开始前取血或放疗后血象恢复正常后取血；d） 连续两个疗程治疗时，取血和回输细胞在时间上会有交叉，取血必须在细胞回输之前。7.2 采血用具的准备7.2.1 细胞制备中心提供材料：一次性使用真空采血针组件（Blood Collection Set）；肝素抗凝管；采血袋。7.2.2 临床科室自备材料：棉签、碘伏、胶带和止血带。7.2.3 采血见附件中采血操作规程。8 回输及注意事项8.1回输日期的通知和确认8.1.1 业务员在采血后一周内以E-MAIL形式通知主管医生下周回输安排，并以电话、短信形式提醒医生查看E-MAIL。8.1.2 确定本次回输不受其他治疗因素，尤其是患者感染、发烧、放疗、化疗、转院、出院等的影响。如果因为患者自身或其他原因，需要改变回输时间，一般只能上下浮动1-2天。8.1.3 细胞制备中心如发现因细胞增长原因，培养时间需要延长，将及时告知主管医生。8.2 AIL细胞的包装和质量检验单8.2.1 标准回输袋100mL AIL细胞悬液，细胞回输袋外标注有患者姓名、细胞编号、患者所在医院、产品出库时间：即当天日期的标签。8.2.2 接收产品者还应同时获得产品验收单，包括：a） 细胞质量报告单（包括微生物检测、内毒素检测和产品细胞数量，并有报告人和审核人姓名，同时加盖质检章）；b） 细胞回输签收单。8.3 AIL细胞的运输8.3.1 细胞储存于细胞运输箱，箱内放冰袋，保持箱内温度在10-20度，通过专人运输或快递的方式送至医生指定地点。8.3.2 由主管医生或护士a） 签收产品和产品质量报告；b） 在AIL细胞回输签收单上签名。8.4 AIL细胞回输8.4.1 所需物品：a） 生理盐水、治疗盘及相关物品（由医院提供）；b） 输血器、7号或更大号套针管（由公司提供）。8.4.2 操作人员：医院相关医务人员8.4.3 回输前首先核对AIL细胞袋标签姓名与患者姓名是否一致8.4.4 回输方法：a） 连接100mL生理盐水与输血器，将输血器原装所带大号针头换成套管针并排气；b） 将针头与病人血管连接固定，观察生理盐水点滴情况；c） 预处理：一般不需任何预处理，但若患者为过敏体质或其它情况需根据医嘱加入相应处理，比如回输前提前15分钟肌肉注射非那根25mg；d） 如果生理盐水点滴通顺，换上细胞转输袋，调节速度为30-40滴/分；e） 一般病人观察10分钟后如没有特殊反应，将滴速改为60-80滴/分，直至输完；若患者有心血管方面疾病应按医嘱控制滴速。回输过程中可叮嘱家属或护士每隔5-10分钟轻轻挤压转输袋底部，使沉淀细胞重新悬浮；f） 细胞回输完毕后将输血器连接上剩余的生理盐水，冲洗输血器内剩余的细胞；g） 管内细胞冲洗干净后回输完成。8.4.5 回输时要保持室内环境空气流通，注意保暖。在细胞回输后的48小时内，患者要保持休息状态，放松情绪，保证足够的睡眠，不宜做剧烈运动，不要长途奔波劳累；9 其他注意事项9.1知情同意书书面证明患者本人或家属已了解AIL细胞治疗的情况并同意接受治疗，由医院保留。9.2回输方案的制定单独使用AIL细胞时，一般在采血后第14天开始第一次回输，具体回输计划在采血后7天内告知主管医生；如AIL细胞配合手术、放化疗使用，需要医生提供手术、放化疗的疗程及时间安排，并与公司技术人员一起制定回输计划，并确定采血时间。9.3 血液、细胞的储存及运输要求血液样本采集完成后要求在10-20之间储存，采血管垂直放置，采血袋水平放置，8小时内运输到达实验室；细胞在收获后回输前要求在10-20之间储存和运输，在12小时内完成回输。附件：AIL细胞治疗采血操作规程人员：相关医务人员要求：洁净无菌用品：真空抗凝管（绿盖，9mL/管）一次性使用真空采血针组织件持针器治疗盘（棉签、碘伏、胶带和止血带）步骤：1 根据治疗方案确定采血量，准备好所需抗凝管并进行相应标记（患者姓名和日期）。2 用碘伏消毒所用真空抗凝管管盖中部橡皮部位（例：如需采血63mL，则需7个抗凝管）。3 链接采血针和持针器，皮肤消毒进行静脉穿刺。4 见回血后，将消毒好的真空抗凝管插入持针器，管内装满血液后将抗凝管拔出，插入下一个抗凝管进行采血。装有血液的抗凝管上下颠倒5-10次混匀。最后一管采满血取出后，拔出针头按压止血，并将所有抗凝管放入做好相应标记的采血盒中。5 运输员核对采血袋与所有抗凝管上标记一致后将袋放入采血盒中，填好采血盒上标签后粘贴封条，将采血盒放回10-20细胞运输箱，尽快送回实验室。6. 在治疗实施过程中少数人可能出现以下并发症并导致不良后果：A 静脉穿刺部位红肿、痛痒、瘙痒；B 畏寒、发热、疲乏、胸闷、恶心、呕吐；C 一过性低热、毛细血管渗漏综合征；D 治疗达不到预期效果；E 发生其他不能预见的并发症上述副作用均为一过性反应，具有自限性。大部分症状不需处理。但为防止可能发生的过敏性反应，回输时应准备退烧药物以及像苯海拉明、地塞米松、肾上腺素等抗过敏性药物。发生高热、严重皮疹，低血压时，应及时对症治疗。山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司咨询电话：0531-88230072, 88230074地址：山东省济南市高新区出口加工区港兴三路1109号邮编：250101