检验医学专业实验III临床生物化学检验部分.doc

分光光度法测量【理论依据】朗伯比耳定律：当溶液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律，当一束单色光通过一定浓度范围的稀 有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c（g/l）或液层厚度b（cm）成正比。其定律表达式A=abc （a是比例系数）。当c的单位为mol/l时，比例系数用表示，则A=bc称为摩尔吸光系数。其单位为L/（mol*cm）。它是有色物质在一定波长下的特征常数。分光光度计性能检查波长检查：根据溴甲酚绿在610nm有最大吸收峰，检测722分光光度计的波长测定是否准确。方法：580nm630nm，每5nm测定一次溴甲酚绿（BCG）的吸光度，记录数据。线性检查：根据朗伯比尔定律，溶液吸光度与溶液的浓度成正比。用一种有色物质配成不同浓度，在一定波长及一定浓度范围内确知其服从比尔定律，检查仪器本身是否能够如实的反映有色物质的浓度变化。一、双缩脲法测定血清总蛋白【原理】：血清中蛋白质的肽键在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色化合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子形成紫红色的反映相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，其吸光度与血清蛋白含量在一定范围内成正比，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。双缩脲试剂中，酒石酸钾钠的作用：结合Cu2+，防止其在碱性条件下形成CuO沉淀。KI的作用：防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析。【参考范围】健康成人：走动后为6483g/L，静卧时为6078g/L【临床意义】浓度增高见于：血浆浓缩（如急性脱水、外伤性休克、慢性肾上腺皮质功能减退） 、蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）浓度减低见于：血浆稀释（静注过多低渗溶液、水钠潴留）、营养不良或消耗增加（长期低蛋白饮食或慢性肠道疾病；长期患消耗性疾病）、蛋白质合成障碍（肝功能严重受损、此事宜清蛋白减低最为显著）、蛋白质丢失（严重烧伤、大出血、肾病综合征、溃疡性结肠炎）。二、溴甲酚绿法测定血清清蛋白【原理】：溴甲酚绿（BCG）在pH4.2的环境中，在有非离子去污剂存在时，可与清蛋白（Alb）结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色深浅在一定范围内与清蛋白含量呈正比，与同样处理的清蛋白标准液比较，可求得血清中清蛋白的含量。非离子去垢剂（Brij-35）的作用：提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性。【参考范围】成人为3555 g/L，A/G=1.21.5（1.0称为A/G比例倒置）【临床意义】 清蛋白的主要功能是调节血液的胶体渗透压。28g/L临床上出现水肿。浓度增高见于：严重脱水导致的血浆浓缩浓度降低见于：Alb合成不足/障碍（肝脏疾病，尤其是肝功能严重损害）、Alb的分布异常（门静脉高压）、蛋白质丢失（大出血、烧伤）、Alb摄入不足或消耗增加（见于营养不良、肠道肿瘤、肝功能受损、肾病蛋白尿、结核病伴慢性出血、恶性肿瘤等）。无清蛋白血症(analbuminaemia) ，极少见，患者血清中几乎无Alb相关：质控图绘制【原理】：质控图是一种具有质控界限的图形。以质控品测定结果计算均值和标准差（S），以2S为警告线，以3S为失控线绘制质控图。正常分布：正常分布规律：常见异常图形：一、乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯【原理】：血清甘油三酯（TG）经正庚烷-异丙醇抽提，然后用氢氧化钾皂化，所生成的甘油再被过碘酸钠氧化成甲醛，后者在铵离子存在下与乙酰丙酮反应，生成带荧光的黄色物质即3，5-二乙酰-1，4-二氢二甲基吡啶，颜色深浅与血清甘油三酯浓度成正比。与同样处理的标准液比较，求得其含量。抽提：正庚烷-异丙醇-稀H2SO4皂化：KOH-异丙醇使TG水解生成甘油氧化：甘油 +过碘酸钠（酸性pH）甲酸+甲醛显色：甲醛+乙酰丙酮 （NH4+）3，5-二乙酰-1，4-二氢二甲基吡啶【理想范围】1.7mmol/L二、测定血清总胆固醇【原理】：血清脂类包括甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯、磷脂、糖脂、游离脂肪酸。它们在血液中以脂蛋白（脂和载脂蛋白的复合体）的形式存在。用超速离心技术可把血浆脂蛋白分成四大族：CM、VLDL、LDL、HDL，用电泳技术可把血浆脂蛋白分成-脂蛋白、前-脂蛋白、-脂蛋白、CM。血清中总胆固醇（TC）包括游离胆固醇FC和胆固醇酯（CE）两部分。胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成4-胆甾烯酮和过氧化氢，H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。胆固醇酯 + H2O （胆固醇酯酶） 胆固醇 + 脂肪酸胆固醇 + O2 （胆固醇氧化酶） 4-胆甾烯酮 + H2O2H2O2 + 4-氨基安替比林 （过氧化物酶） 醌亚胺 + H2O【理想范围】5.2mmol/L。升高：5.72mmol/L一、血清钙测定【原理】：血钙+邻甲酚酞络合铜（OCPC） （pH=11.0）紫红色络合物，这种紫红色络合物在575nm处有最大吸收峰，其吸光度与血清钙含量在一定范围内成正比，经与同样处理的钙标准液比较，即可求得血清钙含量。【参考范围】： 成人为1.101.34mmol/L，儿童大约比成人高0.05mmol/L【临床意义】：增高常见于：原发甲亢、恶性肿瘤、维生素D中毒、肾上腺皮质功能降低、骨髓增殖性疾病降低常见于：甲减、慢性肾衰、急性胰腺炎等二、血清磷测定【原理】：无机磷+钼酸铵 H+磷钼酸磷钼酸在650nm处有最大吸收峰，其吸光度与血清磷含量在一定范围内成正比，经与同样处理的磷标准液比较，即可求得血清磷含量。【参考范围】：0.962.10mmol/L【临床意义】血磷受饮食摄入磷的影响较明显，当摄人磷不足时，机体不会像缺钙那样立即动员骨磷人血，而是先出现血磷降低。血清无机磷升高：除见于维生素D 中毒（血钙、血磷均升高）和甲旁减外，以肾滤过磷障碍（如肾衰竭）为常见。另外，也见于多发性骨髓瘤、糖尿病酮症酸中毒治疗前、乳酸性酸中毒、骨折愈合期、肢端肥大症和巨人症等。血磷降低见于：维生素D缺乏、高胰岛素血症、儿童型侏儒症、脂肪泻、甲旁亢和输注大量葡萄糖液后等。三、血清铁、总铁结合力测定【原理】：血清中的三价铁与运铁蛋白结合成复合物，在酸性介质中铁从复合物中解离出来，再被还原剂还原呈二价铁，与亚铁嗪直接作用生成紫红色复合物，在562nm处有吸收峰，与同样处理的铁标准液比较，可求得血清铁含量。总铁结合力（TIBC）：是指血清中运铁蛋白全部被铁饱和所能结合的铁量。将过量铁标标准液加到血清中，使之与未结合的运铁蛋白结合，多余的铁被碳酸镁粉吸附除去，然后测定血清中总铁含量，即为总铁结合力。为了防止外来铁的污染，实验用水必须经过去离子处理。玻璃器材必须用10%（体积比）的盐酸浸泡24h，取出后再用去离子水冲洗，方可运用。【参考范围】：血清铁：成年男性1130mol/L，成年女性927mol/L。血清总铁结合力：成年男性5077mol/L，成年女性5477mol/L。【临床意义】血清铁：增高见于红细胞破坏过多（如溶血性贫血）、红细胞的再生或成熟障碍（如再障、巨幼贫）。减低见于缺铁性贫血、慢性长期失血、恶性肿瘤等。血清总铁结合力：增高见于缺铁性贫血、急性肝炎等。减低见于肝硬化、肾病、尿毒症和血色素沉着症等。家兔糖耐量（OGTT）试验口服葡萄糖耐量试验是一种葡萄糖负荷试验，用以了解胰岛细胞功能和机体对血糖的调节能力，是诊断糖尿病的确诊试验，广泛应用于临床实践中，对于处于其他疾病急性期的患者，可能需要重复进行以明确糖尿病的诊断。【葡萄糖耐量试验】：是检查人体血糖调节机能的一种方法。正常人在服用一定量葡萄糖后血糖浓度暂时升高，但在两小时内血糖浓度又恢复到空腹水平，称为“耐糖现象”。在服用一定葡萄糖后间隔一定时间测定血糖和尿糖，观察血糖水平以及有无尿糖出现，称为糖耐量试验。若因内分泌失调等因素引起葡萄糖代谢失常时，食入大量糖后血糖浓度可急剧升高，或升高极不明显，短时间内不能恢复原值者即为耐糖现象异常，临床常对症状不明显的患者用糖耐量试验来诊断有无糖代谢异常。【原理】葡萄糖+O2+H2O （GOD）葡萄糖酸内酯+H2O2H2O2+4-氨基安替比林 （POD） 红色醌类化合物【参考范围】空腹3.9-6.1mmol/L，1小时血糖上升至高峰11.1mmol/L，2小时下降7.8mmol/L，3小时下降至空腹血糖。【结果判断】：正常为给糖后121小时血糖浓度迅速上升，2小时后恢复至空腹水平，如果服糖后2小时未降至正常水平，且尿糖阳性，即为糖耐量减低。【临床意义】：确诊糖尿病。了解血糖波动范围，分析糖尿病稳定程度。糖尿病患者空腹血糖与餐后3小时血糖值差距越小越稳定，反之则越不稳定。【注意事项】试验前每天碳水化合物摄入量不少于150克，有正常的体力活动至少3天。 过夜空腹1016个小时。 试验前8小时禁止吸烟、饮酒或咖啡，口渴可以饮水。 被试者应尽量注意休息，不做剧烈的体力活动，避免精神紧张，保持情绪稳定。 将75克葡萄糖溶于300毫升温开水中（或每千克体重口服1.75克葡萄糖，每克糖溶与2.5毫升水中），令受检者一次服下，5分钟内饮毕。 分别于服糖前及服糖后0.5、1、2、3小时各采取静脉血一次，并同时收集尿液标本，测定血糖、尿糖和胰岛素及C肽的数值。赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】：丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化L-丙氨酸与-酮戊二酸间的氨基移换反应，生成-丙酮酸和L-谷氨酸。经30min反应后，加入2，4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的两种-酮酸生成相应的2，4-二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和 酮戊二酸苯腙）。在碱性条件下，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500520nm处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为 酮戊二酸苯腙的3倍。据此可以计算丙酮酸的生成量。L-丙氨酸 + -酮戊二酸 （ALT）-丙酮酸 + L-谷氨酸-酮酸 + 2，4二硝基苯肼 （碱性条件）2，4-二硝基苯腙（红棕色，505nm）【参考范围】525卡门单位【临床意义】ALT在肝细胞中含量量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。一、当肝脏受损时，此酶可释放入血，致血中该酶活性浓度增加。ALT是肝细胞损伤的灵敏指标。急性病毒性肝炎时，转氨酶阳性率为80%100%；肝炎恢复期转氨酶正常。但如在100U左右波动或再度上升为慢性活动性肝炎。整整肝炎或急性坏死性肝炎时，再度上升的转氨酶在症状恶化的同时，酶活性反而降低，提示肝细胞坏死后增生不良。预后不佳。慢性活动性肝炎或脂肪肝时，转氨酶轻度增高（100200U），或在正常范围，且ASTALT。肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后很差。其他原因引起的肝脏损害。如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高；某些化学药物如异烟肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高其他可引起ALT不同程度增高的疾病或因素：骨骼肌损伤、多发性肌炎等二、 ALT活性降低见于：磷酸吡哆醛缺乏症。