《仪器分析小结》word版.doc

一、基础内容（一）绪论仪器分析使用较特殊仪器，以物质的物理或物理化学性质为基础的分析方法，分为物理分析法和物理化学分析法，具有灵敏、快速、准确的特点。物理分析法根据物质的某些物理性质，如旋光度、光谱特征、相对密度等，不经化学反应直接进行定性、定量、结构和形态分析的方法。物理化学分析法根据物质在化学变化中的某些物理性质，进行定性分析或定量分析的方法。（二）电位分析法电化学研究化学反应中的电现象，电能与化学能的相互转化及其规律的学科.电化学分析利用物质的电学及电化学性质来进行物质定性和定量分析的一类分析方法，也就是通过测量工作电池的电参数（电压、电流、电量、电阻、电容）的变化从而确定样品溶液的浓度、化学反应进行的程度或者直接称定电极上产物的重量，对样品溶液中待测组分定性、定量分析的一类方法。电位分析法将合适的指示电极与参比电极插入被测溶液中组成原电池，通过测定电池电动势或指示电极电位的变化进行分析的方法，分为直接电位法和电位滴定法。电位滴定法（间接电位法）用指示电极电位的突变来指示滴定反应终点的容量分析方法。化学电池由二个（相同的或不相同的）电极插入电解质溶液中组成的装置，分为原电池和电解池。原电池电极反应可以自发进行，化学能被转换为电能，化学体系的自由能降低。电解池电极反应不能自发进行，当有适当的外加电压时，电极反应才可以进行，电能被转换为化学能，化学体系的自由能增加。电极电位电极与溶液间的电位差。标准电极电位298K，氧化态和还原态的活度为1molL-1时测得的电池电动势（电位）。（三）光学分析导论光学分析法基于物质发射的电磁辐射或物质与辐射相互作用后产生的辐射或发生信号变化来测定物质的性质、含量和结构的一类仪器分析方法。分为光谱法和非光谱法，包括三个过程：1.能源提供能量；2.能量与物质作用；3.产生被检测信号。电磁辐射一种以光速通过空间而不需要任何物质作为传播媒介的光（量）子流。光是一种电磁辐射，具有波粒二象性。电磁波谱电磁辐射按波长顺序排列，包括从射线到无线电波。光谱法物质与辐射能作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。分为原子光谱法和分子光谱法。物质分子中存在一系列电子能级，而每个电子能级中又包含一系列的振动和转动能级。吸收光谱法利用物质吸收光后所产生的吸收光谱来进行分析的方法。产生的必要条件是所提供的辐射能量恰好满足该吸收物质两能级间跃迁所需的能量。M+ hn M*发光光谱法（发射光谱法）物质中的粒子用一定的能量（如光、电、热等）激发到高能级后，当跃迁回低能级时，便产生出特征的发射光谱，利用此发射光谱进行分析的方法。M* M+ hn散射光谱法利用物质对光的散射来进行分析的方法。原子光谱法以测量气态原子或离子外层或内层电子能级跃迁所产生的原子光谱（表现形式为线光谱）进行分析的方法。包括：原子发射光谱法（AES）、原子吸收光谱法（AAS），原子荧光光谱法（AFS）、X射线荧光光谱法（XFS）等。分子光谱法基于分子中电子能级、振动和转动能级的变化产生的光谱（表现形式为带光谱）进行分析的方法。包括：紫外-可见分光光度法（UV-Vis）、红外光谱法（IR）、分子荧光光谱法（MFS）、分子磷光光谱法（MPS）等。线状光谱由若干条强度不同的谱线和暗区相间而成的光谱。带状光谱由几个光带和暗区相间而成的光谱。连续光谱在一定范围内各种波长的光都有，且连续不断，无明显的谱线和谱带。非光谱法物质与辐射相互作用时，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射、偏振等变化的分析方法。分光光度计（光谱仪）用来研究吸收、发射或荧光的电磁辐射强度和波长关系的仪器，包括五部分：光源、单色器、样品容器、检测器和读出器件。（四）紫外-可见光分光光度法单色光具有相同能量（相同波长）的光。混合光（复合光）具有不同能量（不同波长）的光复合在一起。互补色：max（最大吸收波长）吸收曲线中，吸光度最大处的波长，是定性鉴别物质的基础。吸收曲线以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图所得曲线。光吸收具有选择性和加和性。（五）红外吸收光谱法红外光谱又称为分子振动转动光谱，当样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收某些频率的辐射，并由其振动运动或转动运动引起偶极矩的净变化，产生的分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁，从而形成的分子吸收光谱。一般指有机物质在4000400cm-1红外线的照射下，选择性的吸收其中某些频率后，用红外光谱仪记录所形成的吸收谱带。特点：1）红外吸收只有振-转跃迁，能量低；2）应用范围广；3）分子结构更为精细的表征；4）固、液、气态样均可用，且用量少、不破坏样品；6）分析速度快；7）与色谱等联用具有强大的定性功能。红外活性分子产生红外吸收的分子，如非对称分子。反之为非红外活性分子，如对称分子。伸缩振动原子沿键轴方向伸缩，键长发生变化而键角不变的振动。分为对称伸缩振动(s)和不对称伸缩振动(as)。变形振动()又称弯曲振动或变角振动，基团键角发生周期变化而键长不变的振动。分为面内变形振动和面外变形振动。产生吸收峰的条件 ：只有偶极矩大小或方向有一定改变的振动才能吸收红外光而发生振动能级跃迁。线性分子具有3n-5种振动方式，非线性分子有3n-6种。产生红外光谱的两个条件： 1辐射应具有能满足物质产生振动跃迁所需的能量； 2辐射与物质间有相互偶合作用。红外光谱三要素：峰位、峰强、峰形。红外谱带位移影响因素： 1.诱导效应与共轭效应 2.键应力效应（张力效应） 3.空间效应 4.氢键效应 5.振动偶合与费米共振 6.物态变化 7.溶剂影响红外光谱的最大特点是具有特征性。基团频率与一定的结构单元相联系的振动频率。（六）核磁共振波谱法核磁共振定量分析的基础是结构分析。优点：定性测定不具有破坏性，定量测定不需标样，灵敏度、精确度、准确度及分析速度高。核磁共振谱定量分析的基础：各化学环境不同的质子吸收蜂的面积，只与所包含的质子数有关，可直接根据各共振峰积分值的比值推算所代表的各自旋核的数量。NMR定量方法：1、要求： 1.被测物质的结构必须是已知； 2.核磁共振谱线已归属； 3.理想的被测信号是多个质子的单蜂； 4.信号两端的基线位置一致； 5.每一信号需进行5次积分，取平均值。2、分类： 1.内标绝对测定法常用内标：六甲基环三硅氧烷和六甲基环三硅胺 2.外标绝对测定法样品和外标分别放置在两只核磁管中测定，二管直径必须相同，最好使用同一支样品管。样品和外标必须交叉重复测定以提高分析的准确性。 3.相对含量测定法被测样品是由若干已知化合物组成，如果没有合适的内标化合物时，可采用以其中一个组分做“标样”。 4.峰高定量法通过求出样品中某组质子的峰高，求出样品的含量。峰高与自旋-自旋弛豫常数有关，而后者与化合物的类型有关，受局部磁场的影响，故不能直接用于定量。被积信号过于接近而无法准确测定各质子峰积分面积时，可考虑用峰高法进行定量分析，通过实验求出峰高与含量之间的关系，校正误差。（七）质谱法质谱仪：进样系统、离子源、质量分析器、检测器、计算机系统药用植物中的组分提取分析： 低极性组分GC-MS 大极性组分、生物大分子HPLC-MS蛋白质测定：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS） 、电喷雾质谱（ESI-MS）。蛋白质分子量测定： 1、多肽与蛋白质的ESI-MS分析采用正离子方式进行，ESI-MS可以产生多电荷离子峰使检测的分子质量范围扩大。 2、ESI-MS得到的是一簇多电荷的质谱峰群，相邻两簇质谱峰之间电荷数差1。 3、P：多电荷离子质荷比，Mr：蛋白质分子量，Ma：正离子分子量（来源为氢时，Ma=1.0079），Z：多电荷离子带电量故，Mr=(P-Ma)Z=(P-1)Z 4、高分辨质谱求电荷数：，P、P：相邻同位素峰的质荷比蛋白质鉴定：肽质量指纹谱+基于串联质谱多肽测序肽质量指纹谱(PMF)蛋白质的氨基酸序列经酶解为肽段序列，所测得的肽混合物质量数即称为肽质量指纹谱。（八）荧光分析法荧光分光光度法利用物质的荧光光谱进行定性定量分析方法。振动弛豫同一电子能级电子通过与溶剂分子碰撞从高的振动能级返回到最低的振动能级。跃迁的能量转移方式：1、振动弛豫，2、内部能量转移（内转换），3、荧光发射，4、外部能量转移（外转换），5、体系间跨越，6、磷光发射。其中，2、3、4、6可使激发态回到基态。激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间相互碰撞而失去能量（常以热能的形式放出），这种不同物质间的能量转移引起荧光淬灭（熄灭）。荧光熄灭指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用，引起荧光强度降低的现象。荧光熄灭剂引起荧光熄灭的物质。磷光经过体系间跨越的分子降至三线态最低能级，跃迁至基态而发生的光。不同强度、不同波长的激发光不影响（同一物质的）荧光光谱：电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层。Stokes位移荧光波长大于激发光波长的现象。说明在激发和（荧光）发射之间存在一定的能量损失。产生原因：振动驰豫、内转换荧光寿命当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/2所需的时间称荧光寿命，常用f表示。荧光效率激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比。荧光熄灭法利用荧光强度的减小与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系来进行测定含量的方法。荧光产生的两个条件： 1.分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光； 2.必须具有一定的荧光效率。激发光谱与荧光光谱（发射光谱）的关系： 1.Stokes红移 2.互为镜像 3.荧光光谱形状与激发光波长无关 4.荧光强度与激发光波长有关荧光强度影响因素： 溶剂（极性、粘度，强度） 温度（温度，强度） pH（影响离解） 荧光淬灭 散射（干扰）提高检测精度：1、改善散射光因素影响：溶液透明，选择合适测定波长。2、选择合适的溶剂、温度、酸碱度。定量分析方法：1、工作曲线法；2、比例法；3、联立方程式法（多组分）紫外-可见光法也有工作曲线法和联立方程式法，两者也都有单波长和双波长法。（九）原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法根据蒸气相中被测元素的基态原子对特征辐射的吸收来测定试样中该元素含量的方法。分为火焰原子吸收法和石墨炉原子吸收法。准确度、灵敏度高，选择性好，抗干扰性强，适用范围广，但工作曲线范围窄，通常每测定一种元素要使用一种元素灯，使用不便，且对难溶元素和多种元素的测定尚存在困难。原子能级：原子有原子核和核外电子组成，核外电子按照一定规律排列在一定轨道绕核运动，由于不同轨道的能级不同，所以每个电子的能量也由它所处的能级所决定的，意即不同能量的电子发生跃迁时所需的激发能是不一样的。不同能级间的能量差不同且量子化；原子的吸收光谱由原子最外层电子的跃迁所产生的。线系原子由基态向激发态跃迁时，因为可以跃迁到不同的能级而产生的一系列吸收曲线。所有原子光谱线中，由基态向第一激发态跃迁所产生的线最强，也最易发生。由于不同元素原子由基态向第一激发态跃迁所需能量不同，因而这种共振线也各具特征，称为第一共振吸收线，也称为元素的特征谱线。UV-Vis分光光度计：连续光源单色器吸收池检测器AAS分光光度计：锐线光源原子化器单色器检测器原子化过程被测元素由试样转入气相，并转化为基态原子的过程。包括火焰原子化法（常用为乙炔-空气火焰）和非火焰原子化法（最常用的是管式石墨炉原子化器）两种方法。定量分析方法：1、校正曲线法；2、标准加入法；3、内标法（十）色谱法导论色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分与固定相和流动相的作用力不同而达到分离目的。色谱流出曲线或色谱图样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。基线实验条件下，样品加入色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线，反映了S/N（信噪比）大小的稳定性的水平直线。峰高色谱峰顶点与基线的距离。保留值：1、死时间(t0 )不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，与色谱柱的空隙体积成正比。流动相平均流速： ，L为柱长2、保留时间(tR )试样从进样到出现峰极大值时的时间。包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。保留时间为色谱定性依据，但同一组份的保留时间还与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。3、调整保留时间(tR )某组份的保留时间扣除死时间后的时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即tR = tR - t04、死体积(V0)色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。V0=t0Fco，Fco：柱出口的载气流速(ml/min)5、保留体积(VR)从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。6、调整保留体积(VR)某组份的保留体积扣除死体积后的体积。即VR = VR - V07、相对保留值(r2,1)组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长、填充情况及流动相流速无关，又称选择因子或者分离因子：反映两组分间的分离情况，=1，则两组分无法分离，而越大则分离越好。两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。区域宽度：1、标准偏差峰高0.607处的峰宽的一半。2、半峰宽W1/2峰高一半处的峰宽。3、峰（底）宽W色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。色谱流出曲线的意义： 色谱峰数样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。分配系数K一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相浓度的比值。分配比（容量因子或者保留因子）k一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相质量的比值。塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达到平衡（达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H）；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入（以一个一个的塔板体积加入）。 当塔板数n较少时，组分流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。速率理论认为：单个组分粒子在色谱柱内的运动是高度不规则的、随机的，在柱中随流动相前进的速度是不均一的。塔板理论研究的是平衡态，速率理论则从动态角度出发，提出改变色谱条件、控制流速、提高分离效率的理论。色谱分离条件选择：1、两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数（k）决定，即由色谱过程的热力学性质决定。2、每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散（H或n）决定，即由色谱过程动力学性质决定。（十一）气相色谱法气相色谱仪：载气系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、记录系统固定液的选择相似性原则；组分极性差别较大选用极性固定液，沸点差别较大选用非极性固定液。被分离物质固定液主要作用力出峰顺序非极性非极性色散力按沸点顺序，沸点低者先出柱。相同沸点的极性组分先出。中等极性中等极性诱导力和色散力按沸点顺序，沸点低者先出柱。相同沸点的极性组分后出。极性极性静电力按极性顺序出柱，非极性组分先出柱。能形成氢键的试样氢键型氢键力按形成氢键的能力大小出柱。常用检测器浓度型热导检测器(TCD)有机和无机，适用范围广；一般氢气作载气，氮气灵敏度差电子捕获检测器(ECD)只对含有电负性强元素的物质有响应；氮气作载气质量型氢焰离子化检测器(FID)仅用于有机物检测；氮气作载气，氢气作燃气，空气助燃流量关系一般为，N2:H2:Air为1:11.5:10火焰光度检测器(FPD)氦气热离子化检测器(TID)氦气、氮气速率理论应用1、（A=2dp）减小A：粒度较细，颗粒均匀， 一般为6080目或80100目的填料。2、（B=2Dg）减小B：载气线速度较低时用氮气，较高时宜用氦气或氢气；较低的柱温。（1）填充柱100m且不均匀；常压输送流动相；柱效低；分析周期长；无法在线检测。2、HPLC：可用于分离和分析；柱内径26mm，固定相粒径10m且均匀；高压输送流动相，分析速度快；柱效高；采用高灵敏度检测器，分析时间大大缩短；可以在线检测。（II）HPLC与GC比较相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 区别：分析对象和流动相的差别1、GC：分析可气化、热稳定性好且沸点较低的样品；采用惰性气体为流动相，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用；实验过程常需加温。2、HPLC：分析样品范围广，不受样品挥发性和热稳定性的影响；流动相为液体，种类较多，选择余地广；一般常温进行。HPLC分类：按固定相的聚集状态分为液液色谱法（LLC）和液固色谱法（LSC）；按分离机制分为分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法；最常见的是化学键合相色谱法、离子抑制色谱法、离子对色谱法等，其他如亲和色谱法、手性色谱法、胶束色谱法和电色谱法等。化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法，适用于分离几乎所有类型的化合物，是应用最广的色谱法。其均一性和稳定性好；柱效高，重现性好；分离选择性高。化学键合相采用化学反应的方法，将官能团键合在载体表面所形成的固定相。具有使用过程中不流失、化学稳定性好、适于梯度洗脱、载样量大等特点。但流动相的pH应在其相应使用范围内，如28，否则硅胶会被溶解；按极性可分为非极性、弱极性和极性三类。非极性键合相：表面基团为非极性烃基，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）和苯基等，最常用是C18（ODS）。一般来说，长链烷基可使得样品保留时间延长，分离的选择性增加，且载样量提高，稳定性好。弱极性键合相：常见的有醚基和二羟基键合相，使用较少。极性键合相：常用的有氨基和氰基键合相。化学键合相色谱法可分为正相色谱法和反相色谱法，最常用的是反相色谱法。正相键合相色谱法以极性键合相为固定相，如氰基（-CN）、氨基（-NH2）等，并以非极性或弱极性溶剂为流动相，如各种烷烃等，即固定相极性大于流动相极性。主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。反相键合相色谱法以非极性键合相为固定相，如十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等，有时也用弱极性或中等极性的键合相为固定相，流动相则以水为基础溶剂，再加入一些与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙腈等，以调整流动相的极性比例，即固定相极性小于流动相极性的色谱法。适合于分离非极性或弱极性化合物，可用于分子型化合物及离子型或可离子化的化合物（加入抑制剂）的分离。极性键合相的分离选择性决定于键合相的种类、流动相的强度和样品的性质。1、正相键合相色谱中，组分极性越强，吸附越牢，越后洗脱出柱；固定相极性增加，组分保留时间变大，洗脱减慢；流动相极性增加，洗脱能力增强，组分保留时间变小，洗脱加快。一般情况下分离含双键的化合物常用氰基键合相，而分离多官能团化合物则用氨基键合相；流动相常以饱和烷烃加极性调节剂的方式组成。2、反相键合相色谱中，组分极性越弱，疏水性越强，与固定相的亲和力越大，越后洗脱出柱；流动相极性越小，洗脱能力越强，保留时间越短（水增多，保留时间增加）。以长链烷基组成的键合相适合分离非极性化合物，短链烷基键合相则能用于分离部分极性化合物，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物等。HPLC固定相：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。HPLC流动相：不与固定相发生化学反应；对样品有适宜的溶解度；必须与检测器相适应；纯度要高，粘度要小。使用前，需用微孔滤膜过滤，同时还要脱气。在正相和反相色谱中，流动相极性强弱与洗脱能力是相反的相似相溶HPLC速率方程：H=A+Cmu+Csmu，降低流速，可增加H，但流速太低，分析时间长。传质过程组分在固定相和流动相间不断的溶解、扩散、转移的过程。影响此过程进行的阻力称为传质阻抗。为降低流动相的传质阻抗，应降低固定相的粒度，同时选用粘度比较小的流动相，使得分子扩散比较容易。在实验中常用粘度比较低的甲醇或乙腈，而少用粘度比较大的乙醇。HPLC仪器主要由输液系统（高压输液泵以及在线脱气和梯度洗脱装置）、进样系统（手动进样阀或自动进样器）、色谱柱系统（色谱柱以及柱温箱）、检测系统和数据记录处理系统组成，制备型HPLC还备有自动馏分收集装置。HPLC的三大关键部件：输液泵、色谱柱、检测器。等度洗脱在同一分析周期内流动相组成保持恒定的洗脱方式。该法适合于组分数目少，性质差别不大的样品的分离分析。梯度洗脱在一个分析周期内可以程序改变流动相组成的洗脱方式。该法适合分析组分数目多，性质相差较大的复杂样品的分离分析。梯度洗脱可以缩短分析时间、提高分离度、改善峰形、提高检测灵敏度，但是可能引起基线漂移和重现性降低。根据具体情况，可将等度洗脱和梯度洗脱结合起来。线性梯度洗脱是常用梯度洗脱方式，即在一个分析周期内，流动相随时间均匀线性变化。梯度洗脱有两种装置：高压梯度和低压梯度。选择性（专属型）检测器：紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器（安培检测器）。其只能检测某一组分的某一性质，响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。通用型检测器：示差折光检测器和蒸发光散射检测器。检测是一般物质都具有的性质，对所有的化合物均有响应。HPLC的定性分析方法可以分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法，后者又分为化学鉴定法和两谱联用鉴定法。色谱的定量分析需要色谱系统符合一定要求，即要进行色谱系统适用性实验，包括理论塔板数、分离度、峰对称因子、重复性等参数，其中分离度和重复性最具实用意义。HPLC定量分析方法：1、外标法以对照品的量对比求算样品含量的方法。可分为校正曲线法、外标一点法及外标两点法等。2、内标法以待测组分和内标物的峰高或峰面积比求算含量的方法。可分为校正曲线法、内标一点法、内标两点法和校正因子法等。3、内加法将待测组分的对照品加至待测样品溶液中，测定增加对照品后的溶液比原样品溶液中组分的峰面积增加量，以求算该组分含量的方法。（十三）平面色谱法薄层色谱法将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而在此薄层上进行色谱分离和分析的方法。薄层色谱属于固-液吸附色谱。操作步骤：铺板活化点样展开定位(定性)/洗脱(定量)纸色谱法以纸纤维为载体，吸着其上的水为固定相，与水不相混溶的有机溶剂为流动相，物质在流动相的移动过程中被分离的色谱方法。操作步骤：点样展开显色定性定量分析流动相运动的动力来于毛细管运动。比移值溶质移动距离与流动相移动距离之比，与组分及色谱条件有关。Rf=L/L0（0Rf1。吸附薄层色谱在各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程中，利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。组分在薄层板上反复吸附、解吸附，经过一定时间（距离）层析而实现分离。吸附剂为多孔、微粒状物质，常用如硅胶、氧化铝、聚酰胺。1、硅氧交联多孔结构表面有硅醇基（吸附活性中心），与极性物质或不饱和化合物形成氢键，物质极性，吸附能力。吸水失活（110度烘干活化）2、酸性氧化铝（-Al-OH），pH 45，适于分析酸性、中性物质。 中性氧化铝（-Al-OH+-Al-O-），pH7.5，适于分析酸性、碱性和中性物质。 碱性氧化铝（-Al-O-），pH 910，适于分析碱性、中性物质。较佳分离条件的选择必须对样品、吸附剂、流动相三者兼顾考虑： a.被测组分性质（极性大小） b.吸附剂的活性：吸附剂的活性，对被测组分的吸附能力 强极性物质选择弱吸附剂 弱极性物质选择强吸附剂 c.流动相的极性：流动相极性，对被测组分的洗脱能力一般地，吸附剂的极性（活性）选择跟样品相反，展开剂的极性则跟样品相同。洗脱顺序：吸附弱的组分先被洗脱，吸附强的组分后被洗脱。 1、非极性化合物，吸附弱。 2、基本母核相同，分子中取代基的极性越强，或极性基团越多，分子极性越强，吸附能力越强。 3、分子中双键数越多，则吸附力越强。 4、能形成分子内氢键的化合物，其吸附能力降低。一般地，吸附能力：烷烃烯烃醚类硝基化合物酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸类常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏以及紫外显色等。纸色谱分离：K小则上升快，K大则慢。主要用于多官能团或高极性化合物的分析和分离。（十四）毛细管电泳法毛细管电泳（CE）是将电泳技术与高效液相色谱技术相结合形成的一种新的分离分析方法。电泳技术利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，在电场的作用下，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。1、电泳过程必须在一种支持介质中进行，自由界面电泳无固定支持介质，扩散和对流较强，影响分离效果。2、电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可保持待分离物的带电性质的稳定。电泳装置主要包括电源和电泳槽两个部分。毛细管电泳法的原理：以石英毛细管为分离通道，高压直流电场为动力，样品中各组分因淌度（和分配行为）的差异而分离。电场作用下电泳管中的二种运动（迁移）：电泳和电渗。电泳带电荷粒子在电场作用下，向与所带电荷相反的电极运动。电泳淌度单位电场强度（1V/cm）下带电分子的迁移速度，高电场作用下，石英毛细管柱管壁表面的硅醇基电离所成双电层中的水合阳离子整体向阴极移动，驱动毛细管内的溶液向阴极移动，形成了电渗流。电渗淌度：，：介电常数，：双电层电势，：介质粘滞系数电渗在外电场作用下，毛细管内溶液整体朝一个方向运动的现象。电渗流特点：1、平流型2、不管电荷、直径大小，所有粒子电渗流的速度一样。粒子（带正电、带负电、电中性）在毛细管溶液中的运动结果是电泳速度和电渗流速的矢量和。不同组分的混合物得以分离是电泳和电渗共同作用的结果：1、大多数条件下电渗的速度是电泳速度的几倍，所以所有的粒子均会从负极流出。带正电的粒子先流出，中性粒子次之，带负电的粒子最后流出。正电荷粒子，荷质比越大，越先流出；负电荷粒子，荷质比越大，越后流出；中性粒子不分先后。2、电渗流太快，则组分未分离就流出柱；电渗流太慢，则分析时间长，焦尔热高，分离度低。电渗的控制较易实现，故成为CE操作中的要素。电渗流的改变，最主要通过改变缓冲溶液的pH值来达到：pH，veop；pH，veop焦尔热是电流通过缓冲溶液时溶液产生的自热，不利于电泳的快速高效。解决方法：（1）Edc1/31500E：电泳电场强度，d：毛细管内径，c：介质浓度一般取25100m管内径（2）采用低电导缓冲液表观电渗淌度：，tm：迁移时间，L：迁移距离，V：电泳电压（E=V/L）分离度： 理论塔板数： 或者，Dm：扩散系数常用分离模式：毛细管区带电泳、胶束电动毛细管电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管电色谱、非水毛细管电泳。I.毛细管区带电泳也称毛细管自由区带电泳，其内充液为一定pH值的缓冲溶液。1、V，tm，n，但同时焦耳热，故应选取合适V。2、缓冲溶液的选择直接影响粒子的迁移和分离，还影响进样：（1）要求自身淌度低，即分子大而电荷小；（2）对于两性电解质，pH影响其所带电荷种类及多少，pHpI带负电；（3）高浓度缓冲下，组分间、组分与管壁间作用减少，有利于分离，但c，电渗，tm，焦尔热，对分离又不利。II.胶束电动毛细管电泳色谱能用于中性物质的分离。（十五）色谱联用技术为何要联用？色谱分离能力强，质谱定性、结构分析能力强，两者联用，取长补短，更快、更高效。GC-MS、HPLC-MS、CE-MS、GC-FTIR、HPLC-FTIR、HPLC-NMR、HPLC-NMR-MS色谱联用特点：1.分离和定性一气呵成；2.定性指标多而全；3.灵敏度高；4.应用范围广全扫描对指定质荷比范围内的离子全部扫描并记录。色谱-质谱三维谱全离子（Total Ion）色谱图或总离子流色谱图总离子强度随时间变化的曲线。选择离子（Select Ion）监测图选择一定m/z的离子进行扫描。扫描时对选定的离子进行检测，其它离子不被记录，能提高灵敏度，改善峰形和准确度，主要用于定量分析。选择反应监测质量色谱图又称提取离子色谱图，是由全扫描质谱中提取一种质荷比的离子得到的色谱图。离子化方式：EI（电子轰击离子源）、FAB（快原子轰击离子源）、ESI、MALDI、API（大气压电离源）接口（1）要求：1.组分能进质谱2.维持真空度3.不发生化学变化4.有效传递的重复性5.控制简单、方便、可靠6.接口短（2）目的：GC-MS：除载气；降压；富集（3）分类：GC-MS：一般式（直接导入型、分流型、浓缩型）和特殊式HPLC-MS：电喷雾离子化接口（ESI）、大气压电离源如大气压化学离子化接口（APCI）常见的离子化方式有两种：一种是样品在离子源中以气体的形式被离子化，另一种为从固体表面或溶液中溅射出带电离子。很多情况下进样和离子化同时进行。质量分析器：四极杆、离子阱、TOF，两个主要技术参数是所能测定的质荷比范围（质量范围）和分辨率。MS-MS串联：时间串联和空间串联二、公式小结1、Nernest方程：Red Ox + e课件给出数值：R=8.314、F=96487，实际用下式即可：2、气相色谱D=2N/S或者3N/SD检测限或敏感度，某组分峰高恰为噪音（N）的2或3倍时，单位时间内载气引入检测器中的该组分质量（g/s）或者单位体积载气中所含该组分的量（mg/ml）。S灵敏度或响应值，1ml载气携带1mg某组分通过检测器所产生的电压，或者每秒钟1g组分被载气携带通过检测器所产生的电压。3、朗伯-比尔定律A=EbcA：吸光度，A=-lgT（T=I/I0，称为透光率）E：吸光系数，b：比色池厚度（cm），c：浓度（mol/L或者质量百分数）E分为摩尔吸光系数和质量吸光系数，两者关系为： ，其中M为分子量。（1）条件：1.单色光；2.稀溶液；3.吸收溶质形式不变。（2）当T=0.368，即A=0.434时测量误差最小。透光率20%65%，A为0.20.7时，浓度相对误差在约3倍T以内。4、色谱基本公式（1）速率理论：H=A+B/u+Cu（Van Deemter方程）H：塔板高度，A：涡流扩散系数，B：纵向扩散系数，C：传质阻抗系数，u：流动相线速度a.涡流扩散项A与流速u无关；b.低流速区(u小)，B/u大，分子扩散占主导；c.高流速区(u大)，Cu大，传质阻力占主导；（2）塔板理论：H=L/nL：有效柱长，n：塔板数或tR：保留时间，W：峰宽，W1/2：半峰宽。其中，W=4，W1/2=2.355（：标准差），即W=1.669 W1/2色谱柱的长度一定时，理论板数目n越大，色谱峰越窄。（3）分配系数和保留因子分配系数：，保留因子： s：固定相，m：流动相色谱基本保留方程（保留时间与保留因子的关系）：tR=t0(1+k)(a) 色谱条件一定时，K或k值越大，则组分的保留值也越大。(b) 两个组分的K或k值差别越大，则相应的两色谱峰相距就越远。（4）分离度（一般要求R1.5）或色谱分离方程：，其中=k2/k1，分离因子5、电磁辐射基本公式（1）=c/：波长，：频率，c：波速（2）波数：=1/（3）E=hE：光量子能量，h=6.62610-34：普朗克常数6、荧光分析荧光效率7、NMR定量（1）峰面积：A=HM：旋磁比，H：外磁场强度，M：质子数（2）信号强度（峰高）：=-HT2M：旋磁比，H：外磁场强度，M：质子数，T2：自旋-自旋弛豫常数（与质子具体环境有关）（3）内外标测定法：，其中，M：分子量，n：质子数（4）相对含量测定：三、综合解谱可能化合物（1）三聚氰胺（Mr=126）MS13C-NMRIR（2）阿司匹林（Mr=180）MS13C-NMR1H-NMRIR（3）非那西丁（Mr=179）MS13C-NMR1H-NMRIR（4）1,2-二甲基苯（Mr=106）MS13C-NMR1H-NMRIR四、复习题（基本内容以外的补充）1、为什么不用峰宽来计算理论塔板数？答：因为实际流出曲线图上色谱峰并不规整，不便于求出峰宽，所以选用较易取得的半峰宽。 2、怎样提高色谱柱的理论塔板数n，从而提高色谱柱的效率？答：根据塔板理论n=L/H，通过减少理论塔板高度和增大有效柱长可以提高色谱柱理论塔板数。（1）根据速率理论，减小固定相粒度，增大其均匀性，减小流动相粘度，以及控制合适的柱温、选择合适的流动相线速度，有助于理论塔板高度的减少；（2）加长色谱柱工作部分可以增加有效柱长。一般来说，由于色谱柱的强度限制、色谱仪本身的限制，常通过减少理论塔板高度来提高理论塔板数。3、怎样装柱才能提高色谱柱的效率？答：根据实际需要，一般固定相颗粒应当小且均匀，选择合适固定液加入，且应当适量，既保证均匀完全的涂覆，又尽可能薄。此外，装柱应当均匀无气泡，沉降充分不分层。4、空心柱是否能够用于色谱分离？答：可以。只要在柱内有合适的固定相与流动相中的被分离物结合，并能保证k值合适，就能选用空心柱进行色谱分离。例如，空心毛细管气相色谱在毛细管内壁涂覆固定液，既能保证合适的k，又能增大有效柱长、减弱涡流等影响，提高柱效。5、如何获得色谱最佳流速？答：根据速率理论可知，H=A+B/u+Cu，故存在一个最佳流速。实际操作中，要根据所用色谱、固定相颗粒大小、流动相的性质、柱温等选择合适的流速。对于HPLC，降低流速有利于减小H，提高柱效，但是流速过低，分离时间又太长，应根据具体情况合理选择。6、在AAS中，吸收度与原子浓度的关系如何？答：AAS也遵循朗伯-比尔定律，积分吸收与待测元素原子的总数呈简单的线性关系。一般情况下，常采用峰值吸收来进行定量分析。此时要求光源的吸收线与原子吸收线的中心频率一致，所用光源为锐线光源，而吸光度与浓度的关系可简化为：A=Kc。7、固定相粒度大小对速率理论中的哪些因素有影响？答：固定相粒度大小对于速率理论的涡流扩散项A和传质阻抗项C都有影响，粒度越小，A、C越小。8、毛细管电泳与高效液相色谱比较有哪些不同，毛细管电泳有哪些特点？答：相比HPLC，HPCE的特点可概括为：高效、快速、低耗、应用广泛。9、为什么毛细管电泳法有很高的理论塔板数？答：由可知，对于一定化合物，其a、DE一定，在一定范围内提高电泳电压V，可以有效提高CE的理论塔板数。10、荧光效率与分子结构间关系？答：1、共轭体系增大，则荧光效率增大；2、刚性共平面，则荧光效率增大；3、吸电子则降低，给电子则增大。（类似对红外吸光强度的影响）