包涵体纯化方案.doc

包涵体纯化方案缓冲液配方：1.变性复性缓冲液缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl,1%Triton X-100缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M脲素缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M盐酸胍溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，10mM -巯基乙醇/DTT，2mM脱氧胆酸钠，8M脲素复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸，5%甘油，0.2%PEG，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽2.纯化缓冲液Binding buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5Elution buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5具体实施步骤：1.大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min收集沉淀。3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min，然后13000rpm离心10min。取上清。4.将上清稀释至0.1-1.0mg/ml，装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中，4缓慢透析24-36h。最后在纯化binding buffer中透析，确保蛋白稳定可溶。5.对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。附注：EDTA防止蛋白降解NaCl一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力Triton X-100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白-巯基乙醇/DTT作为还原剂打开错配的二硫键脱氧胆酸钠作为离子型去垢剂能促溶蛋白甘氨酸、甘油促溶PEG可逆修饰折叠中间体的疏水基团氧化型和还原型谷胱甘肽促进二硫键的形成。(11)1g菌使用35ml液体重悬即可。