《植物检疫分子水平标准物质研制规范》.doc

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号RB中华人民共和国认证认可行业标准RB/T XXXXXXXX植物检疫分子水平标准物质研制规范The specification for preparation of molecular reference materials for plant quarantine（征求意见稿）（本稿完成日期2015年9月）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施中 华 人 民 共 和 国国家质量监督检验检疫总局 发 布目 录前言I引言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 组织要求25 植物检疫分子水平标准物质侯选物26 植物检疫分子水平标准物质的制备37 均匀性检验88 稳定性检验109 定值1110 质量检验1111 标准物质的保存1212 标准物质的管理1213 包装、贮存与运输12前言本标准是根据GB/T1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写中的要求进行编写的。本标准是在参考GB/T 15000.7-2012标准样品工作导则(7)标准样品生产者能力的通用要求的基础上具体和细化了植物检疫领域分子水平标准物质的技术要求。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 本标准主要起草人：边勇、赵晓丽、高文娜、汪万春、王有福、刘来福、刘艳华、李岩、梁新苗、郑春生、骆卫峰、邓丛良。本标准系首次发布的认证认可行业标准。引言标准物质作为开展测量仪器校准、测量方法评价确认、测量过程质量控制等方面的重要工具，随着全世界对检测结果可靠性和可比性的不断追求，正得到越来越广泛的应用。巨大的需求推动了标准物质领域的快速发展，无论品种还是应用领域都不断得到扩展。标准物质正由钢铁、地质、环境等传统领域不断向生物、临床、新材料等领域拓展，近年来用于法医鉴定、医学诊断、基因测试、微生物检测等领域的定性分析用标准物质以及大量应用于实验室内部质量控制的的标准物质发展迅速。在理化等领域，标准物质的生产体系及要求已相对规范，然而在植物检疫领域核酸、质粒等标准物质的研发尚处于起步阶段，在植物检疫领域分子水平标准物质的分类具有其自身特点。核酸的计量以含量、序列为主；蛋白质计量主要包括含量、酶活、免疫、结构等；微生物计量则刚刚开始，以鉴定和定量研究为主。由这些分类可以看出其不同于理化类标准物质的独特要求，使得其生产研制规范成为一种需求。本标准以此为目的，结合ISO/REMCO标准物质国际导则、CNAS-CL04：2010标准物质及标准样品生产者能力认可准则、CNAS-RL07:2014标准物质_标准样品生产者认可规则以及检验检疫行业标准SN/T 3461-2012植物病原菌标准样品制备要求等一系列文件的具体要求为参考，以规范植物检疫领域分子水平标准物质生产的技术流程，明确制备要求和评价原则。内容涉及原料来源及真实性确认、病原扩繁规范及标准化条件、生物安全性、均匀性、稳定性、样品赋值及协作标定的技术规范；确定对以上技术规范评定的原则和一般流程、认可重点。最终指导相关生产者建立符合要求的植物检疫领域分子水平标准物质的生产体系。植物检疫分子水平标准物质研制规范1 范围本标准规定了制备植物检疫分子水平标准物质的操作流程和技术要求。本标准适用于植物检疫分子水平标准物质的制备。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 15000.4 标准样品工作导则(4)标准样品证书和标签内容GB/T 15000.7 标准样品工作导则(7)标准样品生产者能力的通用要求CNAS-CL04 标准物质/标准品生产者能力认可准则JJF 1005 标准物质常用术语和定义JJF 1006 一级标准物质技术规范JJF 1186 标准物质认定证书、标签编写规则JJF 1218 标准物质研制报告编写规则JJF 1135 化学分析测量不确定度评价3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 植物检疫 plant quarantine旨在防止危险性有害生物传入和（或）扩散或确保其官方防治的一切活动。3.2 原始样品 primary sample 用于制备标准物质的有害生物样品。3.3 长期稳定性 long-term stability在规定贮存条件下标准物质特性的稳定性。3.4 短期稳定性 short-term stability在运输条件下标准物质在运输过程中的稳定性。4 组织要求4.1 标准物质制备单位应具有明确的法律地位，应按GB/T 15000.7-2001中4.1规定建立质量管理体系，并获得基于GB/T 15000.7要求的标准物质生产者资质认可。4.2 标准物质制备单位应达到CNAS-CL04规定的生产者能力的通用要求，具备标准物质制备所必需的工作场所、仪器设备、专业人员及管理等条件。4.3 从事植物检疫分子水平标准物质研制的场所，还应具备防范生物安全风险的条件和措施。4.4 标准物质的评审，应按照JJF1006、JJF1186、JJF1218进行文件编写。5 植物检疫分子水平标准物质侯选物5.1 侯选物的选择5.1.1 侯选物的选择应根据其预期用途确定。5.1.2 侯选物的选择应满足适用性、代表性和容易复制的原则。5.1.3 侯选物应具有足够的用量，以满足批量生产的需求。5.1.4 侯选物的纯度能够满足预期用途。5.1.5 侯选物自身应满足均匀性和稳定性的要求。5.2 侯选物的来源和真实性验证5.2.1侯选物应由标准物质制备单位提供，应具有相对稳定的获得途径；5.2.2侯选物应具有可追溯的、详实的来源信息记录；5.2.3侯选物的真实性应进行验证，并确保采取的真实性验证方法有效。5.2.4侯选物真实性检验的过程应予以记录，并保存所有相关记录，必要时可由多家权威实验室进行联合验证。5.2.5通过扩繁或继代培养的侯选物，其扩繁或继代培养的流程应予以固定，并确保其目标特性量的稳定遗传。5.3 侯选物特性量的筛选5.3.1 侯选物的特性量应具有实际用途和应用价值。5.3.2 侯选物的特性量应相对稳定，其量值在可测量范围内。5.3.3 侯选物的特性量应进行适合性测试，如代表性、检测灵敏度、特异性等。5.3.4 侯选物的特性量及其用途应经过专家确认，并保存相关记录。6 植物检疫分子水平标准物质的制备6.1 制备原则6.1.1 应根据标准物质的预期用途，选择合理的制备程序、工艺。6.1.2 对目标特性量不易均匀的侯选物，在制备过程中应采取必要的均匀措施，并进行均匀性检验。6.1.3对目标特性量存在不稳定因素的侯选物，在制备过程中应采取必要的稳定性措施，并进行稳定性检验。6.1.4 生产和存储分子水平标准物质的器具应确保不存在影响特性量值的因子，如吸附性、渗透性、水溶性等。6.1.5 分子水平标准物质的分装，应在特定条件下进行，避免生物、化学和物理方面的污染，同一批次所有分装单元应在同一时间完成。6.2 植物检疫性有害生物基因组DNA标准物质制备6.2.1 工艺流程侯选物的选择基因组DNA的提取和纯化均匀性、稳定性检验定值测量初步定值及分装保存基因组DNA质量、含量测定标准值确定、不确定度评定6.2.2 植物有害生物的选择根据5.1，5.2，5.3规定的原则，用相应的方法对收集的有害生物进行扩繁培养、生化鉴定和特异性基因片段的PCR扩增实验，结果符合的则用相应的标准方法进行分离、纯化、培养。6.2.3 基因组DNA提取植物检疫性有害生物基因组DNA提取可以用商业化的核酸提取试剂盒，DNA提取物溶解在pH 8.0的TE缓冲液中，并在-20下保存备用。用于制备基因组DNA标准物质的DNA相对分子质量应尽可能大，因此核酸提取过程中操作尽可能温和，提取过程尽量在低温下进行。另外，制备的基因组DNA必须是高纯度的，没有蛋白质和RNA污染，各种离子浓度也应符合要求，提取过程中使用的玻璃器皿、试剂、离心管等一次性用品都应经过严格灭菌消毒。6.2.4 核酸纯度和浓度测定使用紫外分光光度计分别测定230 nm、260 nm和280 nm处的紫外吸收值，计算A260/A280和A260/A230值，来判断提取的基因组DNA纯度。如果A260/A280在1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A260/A230值大于2时，说明核酸纯度较高。制备DNA标准曲线，采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法测定提取的基因组DNA浓度。6.2.5 核酸质量检查 取10 L核酸提取物进行电泳检测，0.8%琼脂糖凝胶电泳，在电压80V-100 V条件下电泳30 min，电泳条带如果清晰明亮、条带单一、无杂带和RNA，则说明提取的DNA质量很好，核酸具有完整性，可以用于核酸标准物质研制。6.2.6 核酸的分装和冷冻干燥将上述基因组DNA分装于内置微量管的样品套管中，每管DNA含量为50 L，置于冻干机中冷冻干燥。冻干后的样品在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，放置于-80贮存。6.3 植物检疫性有害生物质粒DNA标准物质制备6.3.1 工艺流程侯选物的选择克隆基因DNA片段选择设计特异性引物并进行片段扩增质粒标准物质的构建阳性克隆的筛选质粒标准物质的大量提取和纯化质量、含量初步测定均匀性、稳定性检测定值测量初步定值、分装保存标准值确定、不确定度评定基因组DNA的提取和纯化6.3.2 侯选物的选择同6.2.26.3.3 核酸提取 同6.2.36.3.4 目的基因的扩增从NCBI核酸数据库中下载目的基因全序列，通过分子生物学软件比对这些序列并进行引物设计。以提取的基因组DNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增。6.3.5 质粒DNA的构建将纯化后的PCR产物连接到载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞。PCR验证挑选阳性克隆，并送测序。6.3.6 含质粒DNA的菌种的保存将测序正确的阳性克隆转化感受态细胞，以相应的抗生素抗性作为筛选标记，菌种保藏于-80冰箱。6.3.7 核酸纯度和浓度测定 同6.2.46.3.8 核酸质量检查 同6.2.56.3.9 质粒DNA的分装和冷冻干燥将经过质量评估及浓度测定的质粒DNA换算成拷贝数，并稀释到约107 copies/L，混匀后分装于内置微量管的样品套管中，每管DNA含量为50 L，置于冻干机中冷冻干燥。冻干后的样品在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，放置于-80贮存。6.4 植物病毒RNA标准物质制备6.4.1 工艺流程病毒RNA 基因体外转录设计特异性引物并进行RT-PCR扩增病毒RNA基因片段质粒的构建阳性克隆的筛选克隆基因RNA片段选择质量、含量初步测定均匀性、稳定性检测定值测量初步定值、分装保存标准值确定、不确定度评定病毒RNA 的提取和纯化侯选物的选择6.4.2侯选物的选择同6.2.26.4.3 核酸提取植物组织总RNA提取可以通过各种经典方法或商业化试剂盒方法提取，RNA提取物溶解在无RNase的灭菌水中，并在-20下保存备用。为了得到完整的、高品质的RNA，在整个RNA制备过程中应避免RNase对RNA的降解。由于RNase几乎是无所不在，所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。操作过程中操作人员需戴口罩和勤换手套；提取过程中使用的移液器、工作台、玻璃器皿、离心管等必须用表面去污净化溶液处理过；操作过程尽量保证在低温下进行。另外，提取的RNA必须是高纯度的，没有蛋白质和DNA污染，各种离子浓度也应符合要求。6.4.4 目的基因的扩增从NCBI核酸数据库中下载目的基因全序列，通过分子生物学软件比对这些序列并进行引物设计。以提取的总RNA为模板，通过设计的引物经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，然后再以cDNA为模板，通过聚合酶作用扩增目的基因片段。6.4.5 目的基因与体外转录载体连接 将获得的目的基因片段与体外转录载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取质粒，经PCR鉴定为阳性后进行质粒的提取。6.4.6 目的基因的体外转录 对上述重组质粒进行序列分析后，选用限制性内切酶对质粒完全酶切线性化后作为模板，用体外转录试剂盒进行体外转录，最后将得到的RNA沉淀溶于无RNase的灭菌水中。6.4.7 核酸纯度和浓度测定 使用紫外分光光度计分别测定230 nm、260 nm和280 nm处的紫外吸收值，计算A260/A280和A260/A230值，来判断制备的RNA纯度。如果A260/A280在1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A260/A230值大于2时，说明核酸纯度较高。根据紫外分光光度计测定的RNA浓度，根据下列公式计算出每微升体积中体外转录RNA的拷贝数。 A=A拷贝数，单位为copies/L；B浓度，单位为g/L；D每个碱基的平均分子质量；M单链RNA的分子质量，单位为g/mol；X碱基数。6.4.8 核酸质量检查 取10 L RNA进行电泳检测，1-2%琼脂糖凝胶电泳，在电压80V-120V条件下电泳20 min，电泳条带如果清晰明亮、条带单一、无杂带，则说明提取的RNA质量很好，可以用于核酸标准物质研制。6.4.9 核酸的分装和冷冻干燥将经过质量评估及浓度测定的病毒RNA用DEPC水稀释到约107 copies/L，混匀后分装于样品套管中，每管RNA含量为50 L，置于冻干机中冷冻干燥。冻干后的样品在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，放置于-80贮存。 7 均匀性检验7.1 基本要求7.1.1凡成批制备并分装成最小包装单位的植物检疫分子水平标准物质，都应进行均匀性检验。7.1.2所有试料以随机次序进行在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试，检测结果使用方差分析方法进行均匀性评价。7.1.3 植物检疫分子水平标准物质通常采用普通PCR和实时荧光定量PCR进行均匀性分析，必要时可采用数字PCR（Digital PCR）等方法进行检验。7.2 取样方式和取样数目7.2.1 按照JJG 1006-94的规定从分装成最小包装单元的样品中随机抽样。7.2.2 从一批单元中抽取一个子集，对具有代表性的10个30个单元进行均匀性研究，一般不用少于10个。7.2.3 当总体单元少于500个时，抽取单元数不少于15个；总体单元数大于500个时，抽取单元数不小于母体数的3%。7.2.4 根据需要分别在分装的开始、中间和最后抽取，保证总体样品具有足够的代表性。7.3 最小取样量7.3.1 最小取样量多少是由用来检验均匀性所采用的方法决定的，一旦最小取样量确定，该标准物质定制和使用时都应保证用量不少于该最小取样量。7.3.2 最小取样量的确定还应考虑相关植物检疫标准中的规定。7.3.3当一种标准物质有多个待定特性量时，以不易均匀待定特性量的最小取样量表示该标准物质的最小取样量或分别给出每个特性量的最小取样量。7.4 检验方法7.4.1 采用精密度高的试验方法，通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统误差。7.4.2 当所研制的标准物质具有多种特性定值时，应选择有代表性和不容易均匀的待测特性量值进行均匀性检验，并选择同等或高于定值方法的精密度和具有足够灵敏度的测量方法，在重复性的实验条件下进行均匀性检验。7.4.3具备数值统计分析的特性量，应选择合适的统计模式进行统计检验。本标准推荐采用方差分析法即F检验法。F值的计算公式为：F=式中： m 抽取样品数； n 每个样品测定次数； 每个样品测定值的平均值； 所有单个样品平均值的总平均值； xij 每个样品每次测定值。7.4.4 不具备数值统计分析的特性量以反应灵敏度、特异性等作为检验参考。7.5 结果判定7.5.1具备数值统计分析的特性量查F分布表，得临界值F0.05,(m-1),m(n-1) 。均匀性检验结果的评价依据如下：若FF0.05,(m-1),m(n-1) ，单元间方差与单元内方差无显著性差异，样品均匀；若FF0.05,(m-1),m(n-1) ，单元间方差与单元内方差有显著性差异，样品不均匀；7.5.2 不具备数值统计分析的特性量以特异性条带大小的一致性，标准曲线的斜率和截距的一致性进行判定。8 稳定性检验8.1 基本要求8.1.1植物检疫分子水平标准物质在规定的保存或使用条件下，定期进行特性量值的稳定性检验，采用定量PCR进行测定。8.1.2 稳定性检验应在均匀性检验证明样品充分均匀后进行。8.1.3 在稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室都与均匀性测试相同。8.1.4稳定性检验的时间间隔应按先密后疏的原则。在有效期间应有多个时间间隔的检验数据，以确保标准物质的可靠性。8.1.5保存期间需要对分子水平标准物质的稳定性条件进行连续监测。8.2 温度和时间间隔8.2.1短期稳定性测定温度为25和37，测定时间点为0周、1周、2周、4周。8.2.2 长期稳定性测定温度为-20和4，测定时间点为0月、1月、2月、4月、6月、12月等。8.3 样品的抽取8.3.1 考察稳定性所用检验样品应从最小包装单元的样品中随机抽取。8.3.2当标准物质有多个待定特性量值时，应选择那些易变的和有代表性的待定特性量值进行稳定性检验。8.4 检验方法 按照均匀性检验使用的方法进行标准物质的稳定性检验。8.5 结果评价8.5.1 分装成最小包装后的样品按时间顺序进行测量，如测量结果在随机不确定度范围内波动，则该特性量在试验的时间间隔内是稳定的。8.5.2 可以用相应的统计检验方法，如t检验或平均值一致性检验等检验方法进行稳定性检验。8.5.3 标准物质稳定期不少于1年。9 定值9.1 基本要求9.1.1采用多家实验室联合定值的方式对标准物质进行定值。9.1.2定值过程应按照JJF 1006-1994中有关技术及文书要求，均匀性、稳定性检验合格并具有一定数量的标准物质方可进行定值。9.1.3定值的测量方法应在理论上和实践上经检验证明是准确可靠的方法。9.1.4定值过程所用量具和仪器，应在检定/校准合格的有效期内。9.2 定值方法9.2.1 标准物质的定值方式可采用两种或两种以上不同原理的可靠方法定值。9.2.2 当采用多种测量方法时，独立定值组数一般不少于6个；当采用同一种测量方法时，独立定值组数一般不少于8个。9.2.3 汇总定值结果进行格拉布斯（Grubbs）检验法检验，用夏皮罗-威尔克（Shapiro-Wilk）检验法进行正态分布检验，在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，再将每个实验室的测定数值的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据，进行格拉布斯（Grubbs）检验法检验，剔除离群值后将改组数据的平均值作为标准值。对非正态分布的元素以中间值定值。9.3 总不确定度的评估9.3.1 特性量的总平均值即为该特性量的标准值。9.3.2 标准值的总不确定量来源包括：通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置性水平按统计方法计算得出；通过对测量影响参数和影响函数的分析，估计得出；样品不均匀和样品在有效期内的变动性所引起的不确定度。9.3.3 总不确定度的评定方法按照JJF1135-2005中的有关技术及文书要求进行。9.4 定值结果表示定值结果一般表示为：标准值总不确定度。10 质量检验10.1 所研制分子水平标准样品的纯度和浓度应满足分子检测的要求。10.2 一般使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。OD260/OD230值大于2，OD260/OD280值在1.82之间。11 标准物质的保存11.1 分装后的植物检疫性分子标准物质要进行冻干处理，并进行二次干燥处理。11.2 冻干后的分装单位，进行密封处理，密封一般在真空状态下进行或在充斥惰性气体的情况下进行。11.3 密封后的植物检疫性分子标准物质置于-20或-80保存。11.4 需对保存标准物质的环境进行监控（如温湿度），保证保存环境条件的符合性及持续性。11.5 应定期或不定期对在保存期内的植物检疫性分子标准物质进行检查，以保证标准物质有效性和保存环境的适用性。12 标准物质的管理12.1 标准物质制备好后应对其进行合理有效地管理和使用，制定和执行严格的检疫鉴定溯源制度体系，并及时和如实记录标准物质的使用情况，以保证检疫鉴定过程的可溯源性和检测结果的可靠性。12.2 标准物质发生过期、变质、包装破裂、标签破损等情况时，应及时将其从存放处撤除，并用合适的方式处理，以免误用。12.3 为确保所制备标准物质的质量，研制单位应建立标准物质外部评价程序，对所评价对象采取第三方匿名的方式进行，评价至少包括证书规范评价和其特性量值实验评价。证书规范性评价依据ISO导则31和我国标准样品管理办法进行，对特性量值的实验评价包括测量值以及稳定性、均匀性的评价。以上评价独立测量数目不少于6个。13 包装、贮存与运输13.1 根据植物检疫分子水平标准物质的性质选择合适的包装容器材质，确保包装材质不会对标准物质的特性量值造成影响。13.2 包装容器应具有良好的密封性，避免潮湿，标准物质应存放于阴凉、洁净的环境中。13.3 在植物检疫分子水平标准物质的运输途中，应保证低温运输，同时对于玻璃容器应有合适的外包装，并在外包装上写有“易碎品”字样。 _