课题申报书-NO释放型非甾体抗炎药的开发研制.doc

湖北省科技攻关计划课题申请书项目名称：NO释放型非甾体抗炎药的开发研制 课题名称：抗风湿病新药NO释放型噁丙嗪前药的开发研制 申请单位： 主管部门（单位）： 教 育 部 课题负责人： 联系电话： 湖北省科技厅制2 0 0 1 年 1 2 月 1 5 日计算机信息简表项目名称NO释放型非甾体抗炎药的开发研制 课题名称抗风湿病新药NO释放型噁丙嗪前药的开发研制课题领域1、工业；2、农业；3、社会发展；4、软科学课题内容摘要（150字以内）将本课题组自行研制开发的二类新药新型非甾体抗炎药噁丙嗪与硝酸酯有机合成，制得NO释放型噁丙嗪前药，通过体内释放母药及NO发挥各自的抗炎、解热、镇痛及黏膜保护，细胞因子调节以及抑制炎症细胞的黏附和激活作用, 初步完成新药临床前药效学、药动学及毒理学研究，开发出兼具抗炎及免疫抑制功效，且不良反应轻的，具有我国自主知识产权的抗风湿病一类新药。承担单位名称行政主管部门详细地址武汉市航空路13号邮政编码法人代表承担单位机构代码承担单位法人代码单位类别 AA、事业型研究单位（即没有改制的研究单位）；AB、大专院校；AC、政府机关；AD、群众团体；AE、其它事业单位；BA、科研型企业（即转制为企业后的科研院所）；BB、全民所有制企业（即国有企业）；BC、集体所有制企业；BD、个人独资企业；BE、合伙制企业；BF、股份有限公司；BG、有限责任公司；GH、股份合作制企业；GI、中外合资企业；GJ、中外合作经营企业；GK、外商独资企业；GL、港、澳、台投资企业；GM、其它企业单位所在地区武汉市B01 黄石市 B02 十堰市B03宜昌市B05 襄樊市 B06 鄂州市B07荆门市B08 孝感市 B09 荆州市 B10 黄冈市 B11 咸宁市 B12 随州市 B13 恩施州B28 仙桃市 B94 潜江市B95天门市B96 神农架 B97课题联系人联系电话1一. 课题的研究意义和必要性 风湿性疾病(简称风湿病)是一组涉及肌肉骨骼系统、关节、关节周围软组织，并以疼痛症状为主的慢性疾病。其发病率高，致病机制复杂，治愈率低，对该病的治疗学研究一直是国内外药物研究领域的热点。抗风湿药往往分为改善症状的药物（NSAIDs）和控制关节结构受损的药，即慢作用抗风湿药物（SAARD）或改变病情抗风湿药（DMARD）两大类。大多数NSAIDs的共同特点是既抑制炎症部位的PGs生物合成，也抑制对胃黏膜有保护作用的胃肠道的PGs生成。所以长期大量服用该类药物可导致胃肠道溃疡、出血甚至穿孔等严重副作用。慢作用抗风湿药物多为免疫制剂或生化制剂，通过抑制滑膜组织中致炎淋巴因子的形成和表达，阻止淋巴细胞的过度增殖浸润及抗体的产生，同时阻遏胶原酶及基质溶解等金属蛋白酶和过氧化物的生成，促进胶原的合成而发挥作用。目前一些免疫及生化制剂已应用于临床，但由于病例数尚少，药物对风湿病的疗效及安全性尚待进一步观察。对风湿病的治疗，临床大多首先采用NSAID迅速改善症状缓解疼痛，再将两类药结合应用，力求逐步根治疾病。两类药物使用过程中各有其利弊，传统治疗方法虽在治疗上达到一定目的，但给病人在经济上和用药的依从性上带来难题，尤其在中国问题更为突出。如何将风湿病的对症与对因治疗有机的结合起来，研制开发出高效，低毒、用药方便的一类抗风湿新药，既能解决临床实际问题，又能适应医疗改革的需要，是我国加入WTO后医药界面临的巨大挑战。本课题组在自行研制开发成功国家二类新药新型非甾体抗炎药噁丙嗪的基础上，又再接再厉，设计并初步合成和鉴定出NO释放型噁丙嗪前药即将噁丙嗪与硝酸酯有机合成，本课题欲进一步通过药物化学、体内过程及药效学研究完成新药临床前研制工作，开发出可在体内释放噁丙嗪及NO发挥各自的抗炎、解热、镇痛及黏膜保护，细胞因子调节以及抑制炎症细胞的黏附和激活作用, 半衰期长，副作用轻的，可从根本上治愈困扰广大患者的风湿性疾病如类风湿关节炎、骨关节炎、痛风关节炎、强直性脊椎炎等疼痛性炎症，具有我国自主知识产权的新药。5John L.Wallace. Gastroenterology 1997; 112:1000-10166. Stefano Fiorucci, et al. Gastroenterology 1999; 116:1089-1106二. 相关领域国内外技术现状和发展趋势长期以来，胃肠道副作用一直是限制传统NSAIDs在临床上广泛应用的主要原因。降低消化道毒副作用是近年来开发新型NSAIDs的基本立足点，目前受关注的主要有以下几类药物和治疗方法：（1）还氧酶-2选择性抑制剂，如美洛昔康，Celecoxib；（2）还氧酶和5-脂氧酶的双重抑制剂，如处于临床研究阶段的ML-3000，Flobufen等；（3）前体药物，如Piroxicam的前药Ampiroxicam; (4) 局部抗炎药，如Tepoxalin的眼用制剂和用于肠道炎症的Balsalazide等；(5) 合并用药，即将传统的NSAIDs如萘丁美酮、双氯酚酸等与米索前列醇或质子泵抑制剂、H2-受体阻断剂联用；（6）NO释放型NSAIDs。NO是一种信使物质，参与体内多种生理功能的调节。在胃肠道系统中，NO发挥着与PGs相似的调节黏膜完整性和黏膜血流量的作用。同时低浓度的NO可抑制调节细胞凋亡的Caspases活性, 减少促炎细胞因子的分泌和自由基生成发挥抗炎免疫抑制效应。NO释放型NSAIDs在国外引起了极大的兴趣，研究结果表明药物可在体内迅速释放出NO和NSAIDs，一方面保留抗炎解热镇痛作用，另一方面明显减轻胃肠道黏膜损害。药物虽处于临床前研究阶段，且国内尚无开发研制，但它是NSAIDs研究应用的发展趋势，因为它除了具有以上特点外还可以加强NSAIDs的抗炎作用，其应用可从根本上改变风湿病的药物治疗模式。除本课题组研制外，NO释放型噁丙嗪前药的合成国内外均未见报道。噁丙嗪具有具有较好的药代动力学特征，半衰期长(约60小时), 胃肠道不良反应较轻, 患者用药安全、方便，但其药理作用相对于消炎痛、布洛芬、匹罗昔康等非甾体抗炎药较弱，使其应用前景受到限制。因此将能释放NO的结构引入药物分子中，除了发挥母药的作用优势外还可拓宽其作用范围，加强其功效，应用前景将是不言而预的。参考文献1. 姚和权，等。药学进展 2000；24（2）：84-882. 李瑞文，等。药学进展2000；24（3）：145-1483Stefano Fiorucci, et al. J Immunology 2000; 165:5245-52544. Aziz Karim, et al. J Clin Pharmacology 1997; 37:267-278三. 市场需求分析1随着生命科学和人民生活水平的提高，人类对药物的要求从以前的有效性、安全性，向高效、低毒性发展。根据WTO对今后十年世界性新药的研究动态分析显示，抗风湿药为名列前茅的10类药物之一，即为当今重点研究开发药物。2噁丙嗪于1986年由日本研制成功并投放市场。九十年代中叶我院陈帮银教授研制开发出二类新药，投放我国市场。目前，在我国其年销售额约8000万元。NSAIDs是世界范围内处方量最大及销售量最大的药品，其中，噁丙嗪名列第八，作为抗风湿病的一线用药。3NO释放型噁丙嗪属一类新药，其疗效强于噁丙嗪，副作用则比噁丙嗪更轻，且用药方便。目前风湿病特别是类风湿性关节炎，尚无安全、高效治疗药物。因此药物若能迅速研制成功，便可获得知识产权的保护而进入国内外市场，成为抗风湿病药物的主力军，给广大患者带来福音，在不久的将来其市场前景将不可估量。四课题攻关预期目标,具体的考核指标(含主要技术经济指标)1药物化学：合成NO释放型噁丙嗪前药，通过红外光谱、质谱检测结构的正确性2. 药效学：（1）通过整体动物疾病模型确证药物的抗类风湿关节炎作用，且强于母药噁丙嗪；（2）结合RIA法测定滑膜液PGE2含量, 脾细胞Caspases活性及促炎细胞因子TNF-a, INF-g等检测,证明该药融合抗炎及免疫抑制两方面作用特点。（3）通过胃黏膜病理学观察及胃主细胞体外凋亡实验，证实该药副作用较噁丙嗪轻.3. 药代动力学：（1）采用HPLC法, 间接测定前药在体内代谢产生游离NO，及药时曲线.结合药效学进一步证明NO可加强噁丙嗪抗炎作用。（2） GC及HPLC法测定血浆噁丙嗪稳态浓度及药时曲线, 证实前药的成合成，以及母药的完整释放五课题主要研究内容、工艺路线、关键技术(一) NO释放型噁丙嗪前药的合成 (二) N O释放型噁丙嗪前药的药效学和毒副作用实验1. 药物治疗作用 通过小鼠模拟人类风湿性关节炎模型观察前药与噁丙嗪对疾病治疗的不同之处2. 作用特点 （1）活体标本显微镜法观察药物对白细胞血管内皮浸润的影响,证明NO抗炎作用的存在.（2）体内NO释放量与致病小鼠关节肿胀度关系, 提供NO加强噁丙嗪抗炎作用的依据。3 作用机制 RIA法检测关节滑膜液PGE2含量；荧光法测定巨噬细胞内Caspases (即IL-1转化酶样蛋白酶)活性; ELISA法动态测定脾淋巴细炎症因子TNF-a, INF-g, IL-1分泌量, 阐明该前药的抗炎作用机制.4 胃肠道副作用 胃黏膜损伤的病理学观察及胃主细胞凋亡的体外检测(三) NO释放型噁丙嗪前药体内过程的测定1. 采用HPLC法, 通过测定血浆硝酸盐含量，间接测定体内NO释放量以及药时曲线2 GC和HPLC测定噁丙嗪血浆稳态浓度，药时曲线及消除半衰期六课题的主要技术特点和创新点，可能取得专利（尤其是发明专利和取得国外专利）及知识产权分析1本课题将既具黏膜保护作用又有抗炎免疫抑制作用的细胞信使分子NO与新型非甾体抗炎药噁丙嗪结合，两者优势互补，研制成药效强， 副作用轻的抗风湿病一类新药。2课题设计上将抗风湿病治疗中的两大类药物作用融合到一个化合物，研究技术涉及仪器分析、分子免疫及药代动力学的先进手段，充分发挥了药学院及医学院重点实验室的优势。3 NO释放型噁丙嗪合成成功及药效学实验初步完成便可申报新化合物专利 因在国内外各种文献中均未见报道。新药临床前实验完成后可申请一类新药证书，最终取得独立的知识产权。七课题实施年限及年度计划安排1课题如获批准将立即组织实施计划用三年时间完成2. 年度计划安排（1）2002.6-2002.12，合成NO释放型噁丙嗪前药（2）2003.1-2003.6，进行新化合物结构鉴定（3）2003.7-2003.12，进行体内药效学实验及毒副作用研究。 处理实验数据, 整理实验材料, 申报新化合物专利（4）200412004.6 完成体外及半体外作用机制研究（5）2004.72004.12 进行药代动力学试验（6）2005.1-2005.6 总结实验结果,若获其他基金资助,完成新药临床前实验研究, 并准备新药申报材料。八课题总投资预算、安全措施及来源渠道1. 总研究经费： 8.00 万元 其中：自筹经费： 2.00 万元 科技拨款： 6.00 万元 分年度拨款概算： 2002年 2.00 万元 2003年 2.00 万元 2004年 2.00 万元 2. 经费使用预算：支出科目金 额（万元）计算根据及理由合 计6.00科研业务费0.900方法引进、调研、学术交流及业务资料费实 验 费4.00生化试剂、实验动物、原代细胞等仪器设备费0.50补充玻璃仪器、强力搅拌器、色谱柱等协 作 费0.50HPLC、IR、RIA、质谱、电镜等测试费管 理 费0.100水、电等安全管理九课题预期成果的经济、社会、环境效益分析、与国内外同类技术的竞争力分析，成果应用和产业化前景分析1非甾体抗炎药在抗风湿病治疗中起迅速缓解症状作用，应用十分广泛，位于处方量之首，因此陈帮银教授的二类新药噁丙嗪研制成功后，立即开发投放市场，获得年销售额8千万元的骄绩。2NO释放型噁丙嗪前药设计思路新颖，将抗风湿病治疗的两种措施有机结合制备工艺简单，对环境污染小，使用方便安全，综合比较而言，既可为患者消除病痛，满足其特殊的消费要求又可为企业带来巨大效益。3目前国内外均无研制报道，该产品的开发成功将迅速产业化，获的知识产保护，在国内外市场具有强有力的竞争性，为中国制药行业的持续发展及走向世界带来机遇。十课题的风险分析（含技术、市场的风险分析等）本开发研究在技术、工艺等方面不存在问题，研究有一定基础且研究者已掌握其关键技术和方法。噁丙嗪为陈帮银教授开发研制，原料来源也不成问题。市场调研前景广阔。风险主要来自两个国内研究的共同方面，一是资金筹措问题，若有足够的开发研究经费，必将大大加快本项目的开发研究，尽快获得专利保护；二是协调组织管理和各方面的关系问题，理顺了这些关系，问题就迎刃而解。十一.课题的基础条件（与课题相关的现有技术、设备基础和工作基础）1 药物合成方面： 在对噁丙嗪多年研制开发基础上积累了丰富的经验，完善了药物合成的技术条件。课题组已用半年时间合成了目的化合物，并通过IR、MS检测证明结构无误。 2 已将实验室进行了大规模改造，投资引进了与实验检测相关的大型仪器设备，现已有IR、HPLC、MS等，可保证研发的顺利进行。3 药效学实验已通过动物模型初步确定其抗炎作用，本课题组具备整体动物实验，体外细胞培养、酶联免疫检测、荧光分光光度测定等与实验相关技术和设备。十二.课题的关联行动，相关的基本建设、技术改造技术引进、国际合作等落实情况，与其他相关湖北省科技计划（工作）、项目的衔接和分工课题部分工作在药学院中药药理实验室完成，该实验室已引资200万元组建分子靶点体外筛选工作平台。本课题组曾获省自然基金资助，其中的细胞因子检测和免疫组化方面与本课题有相关性，可穿插在该项目研究中。十三.课题的组织管理及相关保障措施课题第一阶段由以陈帮银教授带头的研究小组进行，负责人协调合成与结构检测工作，第二阶段由课题负责人组织药效学研究，并协调*教研室的指标测定，第三阶段仍由课题负责人组织体内过程研究，协调完成。各教研室合作工作可得到科研管理部门协助落实。十四.课题负责人背景资料课题主要参加人员姓名性别年龄专业特长职称、学历工作单位签名十五、承担单位意见 课题负责人为本单位科研及教学骨干，从硕士毕业起，承担多项省级课题研究，课题完成情况较好，与他人协作获得化合物专利一项，完成较高水平论文数篇。该项课题是在长时间工作积累基础上，进一步深入研究开发，希望在药学院研制出第一个一类新药。该课题设计新颖，方法可行，集中与药学相关的多种学科，人员业务素质高，事业心强，有良好的科研协作精神。若课题获得资助，我单位会尽力组织协调各方人员，充分保障研究设备条件，使课题顺利完成。 * 20011215十六、主管部门审查意见十七、省直有关部门或市州科技局意见登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝OA70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性OA患病率2.2%；无症状性OA患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量O2-和H2O2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF）等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：OA软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：NO是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。NOS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为OH-和NO2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和Fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。未针对OA发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝OA与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用PT-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素PGE2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗OA的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入WTO与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗OA的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨OA的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝OA的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键2.2.1膝OA模型的复制目前所使用的OA动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导OA产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发OA，如C57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属（包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征）、不同方法的造模机制和OA模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较成功较高的OA模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，SO染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做OA模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，国内的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培养液居多。在培养液中还含有一些辅助添加剂，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸钠、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10万单位/L的青霉素和10万单位/L的链霉素，PH7.4。培养过程中一般使用5%CO237的恒温培养箱。2.2.3采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查中，一般采用以下几个观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；HE染色观察有关的形态变化；Masson三色染色观察胶原的变化；Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用MTT法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对iNOS、NO含量的测定则使用分型NOS试剂盒和NO试剂盒。2.3目标（达到的主要技术指标或技术经济指标）、技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗OA的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗OA的特色和优势，为临床常见、严重影响人类健康的OA研究出有效、安全、便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简、便、廉、验的中药制剂问世。治疗膝OA的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。3.实验研究方法及技术路线。3.1对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用 OA模型的制备：（1）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约2mm，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液与0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小时后，分别在第1、3、5、7天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液20ul。方法：将造模后的大鼠随机分为模型组、阳性对照组（维骨力组）、治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续7周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，2000rmp15min离心获取含药血清；切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作HE染色，电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈2mm1mm全层软骨标本，2.5%戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨一并切下，10%福尔马林溶液固定24小时以上，分别作HE、沙红-O及Masson三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；HE染色观察有关的形态变化；Masson三色染色观察胶原的变化；Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法（附评分等级表如下）；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。评分等级.结构正常 0表面结构微小不规则 1表面结构中等不规则 2表面结构严重不规则 3过渡层出现裂隙 4辐射层出现裂隙 5钙化层出现裂隙 6过渡层消失 7辐射层消失 8钙化层消失 9结构完全破坏 10.细胞1. 切线的区域正常 0细胞肿胀 1细胞消失 22. 过渡和辐射的区域正常 0少量的细胞增多 1中等量的细胞增多 2大量的细胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的细胞减少 7中等量的细胞减少 8大量的细胞减少 9细胞消失 10.变异标记 完整 0多层 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成没有 0少量 1中等量 2大量 33.2 对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响 3.2.1 兔膝软骨细胞的原代培养 无菌条件下取两周龄新西兰白兔后肢关节，用刀片取关节表面软骨，收集在含磷酸缓冲液（PBS）的无菌小培养皿内，反复清洗除去软骨片表面的血液，以及可能勿带之滑膜组织。漂洗完毕后，用无菌的眼科小剪刀在培养皿中将其细切至不大于1mm3。切碎后将其装入10u试管内，按1：10量加入消化酶类进行化学解离。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%胶原酶消化78小时后，1500rpm10min离心，弃上清，加入PBS，摇匀在同上离心弃上清，在加PBS反复三次，最后一次加含15%胎牛血清DMEM培养液，用吸管轻轻吹打均匀，200目筛网过滤，放入培养瓶中， 5%CO237培养箱培养，定期换液，并观察照相，长满后用0.25%胰酶消化传代。3.2.2 对软骨细胞增殖反应的作用 将在培养瓶中长满的细胞消化，接入96孔培养板中，100ul/孔， 待细胞长成单层后，将旧液弃去，用PBS轻轻荡洗一遍，然后加入含药血清，100ul/孔，每组4个复孔。二氧化碳恒温培养箱孵育72h后，取上清液。每孔加入MTT试剂20ul（5g/L）既无血清培养液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓒液，以主波长570nm，参比波长690nm于酶标仪上比色，读取吸光度（A）值。3.2.3 对软骨细胞的细胞凋亡的影响 单层细胞培养板制作同上，加入含药血清，每组4个复孔，于5%CO237培养箱中培养48h，弃去旧液，用0.25%胰酶消化待细胞有变圆趋势即取出消化液，加入PBS，用吸管轻轻吹打，使成单个细胞悬液，移入离心管离心，1000rpm，5min，去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散，用细滴管或注射器将细胞迅速注入4冷乙醇中（乙醇终浓度为70%），用细胞流式仪检测凋亡细胞数目，计算凋亡百分率。3.2.4 对软骨细胞蛋白合成和NO含量的影响 同样将各组含药血清加入已长成单层细胞的培养板内，CO2恒温培养箱培养48h后，收集上清液，用全自动生化分析仪检测总蛋白含量，用分型NOS试剂盒和NO试剂盒检测各组iNOS、NO含量。3.2.5 拆方后对软骨细胞的影响 进行拆方实验，筛选出补肝肾组方、祛风湿组方和化瘀痰组方三组，对这三组及复方分别进行体外的软骨细胞实验，设立阳性对照组（维骨力组）：细胞毒性实验 将各组方药液用培养基分别配成几个待测浓度，加入已长成单层细胞的培养板内，分别观察24h、48h、72h细胞形态的变化，选择细胞不发生变圆、萎缩、漂浮的最大浓度为药物对细胞的最大无毒浓度，以便继续实验。对软骨细胞的细胞凋亡、增殖、NO含量及iNOS基因表达的影响 将各组方药液分别配置成最大无毒浓度，加入已长成单层软骨细胞的细胞培养板内，具体检测操作则同加入含药血清的实验。4.现有工作条件和基本条件本课题主要承担者是江苏省中医院临床医学研究所。本所具有江苏省科学技术委员会，江苏省标准局颁布的动物饲育环境合格证书，动物质量合格证书，人员素质高，均拥有实验动物从业人员岗位证书。仪器设备先进完善，拥有无菌室，能够进行细胞培养及指标检测等一系列工作，具有较强的科研能力。本组方的提供者是本院的风湿科，该科拥有专科病房（20张病床）及全天专科门诊，同时还开展了专病门诊（包括OA），技术力量较强，技术水平较高，在省内外中西医风湿界均有一定的影响。本课题负责人朱萱萱主任药师，副教授，是省药理学会理事、中华中医药学会制剂分会委员。主要从事中药药理，毒理和中药制剂的研究工作。 养阴生肌膜治疗口腔溃疡的临床及实验研究获省中医药科技进步一等奖、排名第3；保精片治疗前列腺炎的实验研究获省中医药科技进步二等奖、排名第4 ；中医治疗原发性视网膜色素变性临床及机理研究获省中医药科技进步一等奖、排名第5；小儿退热滴肠液的临床研究获省中医药科技进步二等奖、排名第4；洋金花伤膏获省中医药科技进步二等奖、排名第4；克乳痛治疗乳腺炎的临床及机理研究获省政府二等奖、排名第6；津血源治疗干燥综合症的临床及实验获省政府三等奖、排名第5；宫颈宁治疗宫颈炎的临床及实验研究获省中医药科技进步二等奖、排名第5；养心托毒颗粒剂治疗病毒性心肌炎的临床机理研究获省政府三等奖、排名第5；血康糖浆治疗小儿贫血的临床和实验研究获市科技进步三等奖、排名第3；中药缓释口腔粘附片的研制获市科技进步三等奖、排名第1。通过成果鉴定项目有：病毒清眼膜的研制消症饮治疗子宫内膜异位症临床和实验研究强心合剂治疗心衰的临床及实验研究病窦灵治疗窦房结综合症临床及实验研究乌鳖口服液治疗卵巢功能早衰的实验研究 益肾健脾颗粒剂治疗青春期功血的临床和实验研究四通颗粒剂与紫外线照射充氧自血回输结合治疗急性缺血性中风的临床及机理研究 热痹消治疗急性痛风性关节炎的研究 从脾肺论治免疫性溃疡性结肠炎（IUC）的临床和实验研究大黄蛰虫丸对阿霉素肾病伴高血