微生物肥料生物安全通用技术准则NY.doc

微生物肥料生物安全通用技术准则1范围本标准规定了微生物肥料使用菌种安全性分级目录、不同菌种及产品选择毒理学试验的原则、程序、试验方法和结果评价方法。本标准适用于中华人民共和国境内生产、销售的微生物肥料。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 15193.3-2003 急性毒性试验GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1半数致死量 median lethal dose,LD50是经口给予受试物后，预期能够引起动物死亡率为50%的单一受试物剂量，该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是每千克体重所摄入受试物质的毫克数、克数或毫升数，即mg/kg体重、g/kg体重或mL/kg体重。4选择毒理学试验的原则4.1生产用菌种微生物肥料生产用菌种分为四级管理，其安全分级目录见附录A。未列入附录A中的菌种，除根瘤菌和乳杆菌(Lactobacillus）外，其余均需做毒理学试验。4.1.1 第一级（A.1）为免作毒理学试验的菌种。4.1.2 第二级（A.2）为需做急性毒性试验的菌种。4.1.3 第三级（A.3）为需做致病性试验的菌种。4.1.4 第四级（A.4）为禁用菌种。4.2 产品4.2.1 除有机物料腐熟剂以外的固体微生物接种剂类产品均免做毒理学试验。4.2.2 复合微生物肥料、生物有机肥和液体剂型微生物接种剂等需做急性毒性试验。5毒理学试验程序5.1 菌种毒理学试验程序5.1.1 应提供微生物肥料生产用菌种的鉴定资料，包括属及种的拉丁文学名和中文译名、形态、生理生化特性及鉴定依据、功能评价等资料。5.1.2 根据产品所含菌种的鉴定资料，依据附录A之规定，确定菌种安全级别、是否做毒理学试验及毒理学检测项目。5.1.3 对于需要做毒理学试验的菌种，生产者需提供试验用纯菌种斜面，经复核确认与该菌种鉴定资料相符且无杂菌污染后，进行毒理学试验。5.2 产品毒理学程序需对送检产品进行菌种和载体物料的真实性确认后，进行毒理学试验。6试验方法6.1 受试物的准备6.1.1 菌种受试物将试验菌种接种于适宜的培养基中，在适宜的条件下培养一定时间，用生理盐水调整菌液浓度至2.01082.0109cfu/mL，该溶液为菌种受试物。6.1.2 产品受试物固体产品根据试验要求，配制所需浓度，溶剂首选去离子水，也可选用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等。液体产品不可稀释，直接使用。6.2 急性毒性试验按GB 15193.3-2003执行。6.3 致病性试验致病性试验包括以下项目。6.3.1 急性毒性试验方法同5.2。6.3.2 一次破损皮肤刺激试验6.3.2.1 目的检测受试物对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度。6.3.2.2 实验动物每次实验至少需要3只皮肤完好的白色健康家兔或豚鼠。6.3.2.3 操作程序a)涂受试物前，将家兔或豚鼠背部脊柱两侧的毛去掉，去毛范围约2.5cm2.5cm，用75%酒精清洁、消毒暴露皮肤，待酒精挥发后，用灭菌刀片或注射针头分别在两块皮区内划一个“”形的破损伤口。注意皮肤破损仅达表皮，不要伤及真皮。b)将受试物0.5mL直接滴于破损皮肤上，或滴于同样大小的2层4层纱布上并敷贴于破损皮肤表面，然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激胶布固定。另一侧去毛破损皮肤作为空白对照（或溶剂对照），敷贴时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。c)分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应，并按表1进行刺激反应评分。注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别，若有感染可疑，应进行重复测试。6.3.2.4 评价规定在各个观察时间点，按照表1对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分，并按时间点将3只动物的评分相加，除以动物数，获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均值（刺激指数）。取其中最高皮肤刺激指数，按表2评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别。 表1 皮肤刺激反应的评分标准皮肤刺激反应皮肤刺激反应评分红斑形成：无0勉强可见1明显红斑2中等严重红斑3紫红色红斑并有焦痂形成4水肿形成：无0勉强可见1皮肤隆起，轮廓清楚2水肿隆起约1mm3水肿隆起超过1mm4表2 皮肤刺激强度分级皮肤刺激指数刺激强度级别00.5无刺激性0.52.0轻刺激性2.06.0 中等刺激性6.08.0强刺激性6.3.3 溶血试验 6.3.3.1 目的检测受试物是否具有溶血特性。6.3.3.2 操作程序用无菌棉拭子蘸取菌种受试物, 以蛇形线接种于血琼脂平板(按GB/T4789.28-2003中4.6规定),置361培养箱中培养, 24h后观察有无溶血环产生。同时用已知阳性菌株金黄色葡萄球菌等作为对照。6.3.3.3 试验结果 菌落周围有溶血环的，则溶血试验阳性；否则为阴性。6.3.4 抗菌药物敏感试验质控菌株可选用大肠杆菌ATCC25922等标准菌株。6.3.4.1 目的检测受试物对抗生素的敏感性强度。6.3.4.2 试验用抗生素可选用头孢哌酮（CFP）、四环素（TE）、头孢唑啉（CZ）、链霉素（S）、俐特灵（FR）、环丙沙星（CIP）、复方新诺明（SXT）、氯霉素（C）、氨苄青霉素（AM）、庆大霉素（GM）、强力霉素（DO）、丁胺卡那霉素（AN）、甲氟哌酸（PEF）、氟啶酸（ENO）、多西环素(DO)、依诺沙星(ENO)、阿米卡星(AN)等中的几种。6.3.4.3 操作程序a) 用无菌棉拭子将受试物均匀涂抹于营养琼脂平板表面，共涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿,置室温干燥5min。b）用无菌棉拭子蘸取浓度为2.01082.0109cfu/mL质控菌株菌悬液，均匀涂抹于营养琼脂平板表面，具体方法同上，作为对照试验。c)以无菌操作取出抗生素纸片分别贴在涂有受试物和质控菌株菌悬液的平板培养基表面，每个平板放4个纸片。然后将平板置于361恒温培养箱中培养18h后观察抗生素纸片周围有无抑菌环，量取并记录其直径（包括纸片直径）大小，单位mm。试验应做3个平行，取其均值。d)质控菌抑菌环应均在质控范围内，说明试验方法准确可靠，否则试验无效。6.3.5 急性腹腔注射致病性试验6.3.5.1 目的检测受试物的急性致病性。6.3.5.2 试验动物清洁级健康成年小鼠，体重1820g。6.3.5.3 操作程序a）选健康成年小鼠40只,体重1820g，雌、雄各半，剂量为500mg/kgBW，按0.1mL/10gBW经腹腔注射受试物。b）于腹腔注射后第3d、7d分别取存活的实验动物雌、雄各5只解剖，并做大体病理学观察。c)腹腔注射后第14d将剩余实验动物处死、解剖并做大体病理学观察。6.3.5.4 结果观察、评价根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体症、大体病理学观察及病理组织学检查发现病变的程度进行分级判定（见表3）。表3 急性致病性判定标准级 别判定依据强致病性动物出现死亡，死亡动物及24h以上存活动物在第3d、7d经解剖肉眼检查或病理组织学检查即可发现脏器的明显病变。弱致病性动物有中毒体症无死亡，动物第14d经解剖肉眼检查或病理组织学检查可发现脏器的明显病变。无致病性动物无中毒体症无死亡，动物第14d解剖肉眼检查或病理组织学检查均未发现脏器的明显病变。6.3.6 急性眼刺激试验6.3.6 .1 目的检测受试物对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用。6.3.6.2 实验动物3只家兔，试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。6.3.6.3 操作程序a）吸取受试物0.1mL,滴入家兔一侧眼结膜囊内，另一侧眼以生理盐水作为正常对照。b）滴受试物后，将眼被动闭合4s,30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如果72h内未出现刺激反应，或第7d或第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。必要时，用2%荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。6.3.6.4 评价规定按表4对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在三个不同观察时间（24h、48h和72h）角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”（即每只动物的24h、48h和72h评分之和除以观察数3）。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间进行评分，按表5或表6眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。表4 急性眼刺激反应的评分标准眼损害表现评分角膜损害：无溃疡形成或混浊散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见半透明区易分辨，虹膜模糊不清出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见角膜不透明，混浊，虹膜无法辨认01234虹膜损害：正常皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围有中度充血，瞳孔对光仍有反应出血、肉眼可见破坏，或瞳孔对光无反应012结膜（睑结膜、球结膜）充血：血管正常血管充血呈鲜红色血管充血呈深红色，血管不易分辨弥漫性充血呈紫红色0123结膜（睑结膜、球结膜）水肿：无水肿轻微水肿（包括瞬膜）明显水肿，伴有部分眼睑外翻水肿至眼睑近半闭合水肿至眼睑大半闭合01234表5 眼刺激反应分级标准级 别判定依据可逆性损伤无刺激性3只动物的平均评分：角膜损害1、虹膜损害1、结膜充血2和结膜水肿2；或3只动物中至少有2只动物的平均评分符合上述标准，另外1只动物的刺激反应在21d内完全恢复。轻刺激性3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害1；虹膜损害1；结膜充血2；结膜水肿2，且7d内全部动物的刺激反应完全恢复。刺激性a3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害1；虹膜损害1；结膜充血2；结膜水肿2，且21d内全部动物的刺激反应完全恢复。不可逆性损伤腐蚀性b至少有1只动物的角膜、虹膜或结膜的刺激反应在21d的观察期内未完全恢复或/和在3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害3；虹膜损害1.5。注：完全恢复是指动物的眼刺激反应评分：角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1。a 接触受试物后所产生的可逆性炎性反应。b 接触受试物后所产生的不可逆性组织损伤。表6 眼刺激性反应分级标准平均评分动物数（只）恢复时间（d）a损伤类型角膜损害1和虹膜损害1和结膜充血2和结膜水肿21a 为动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1的时间。b 至少有1只动物于21d尚存在角膜粘连或血管翳，也可判为腐蚀性。7结果评价凡毒理学试验结果评价为有毒的产品，不得生产和销售；有毒或致病性试验结果不符合的菌种,均不得作为微生物肥料生产用菌种。7.1 急性毒性试验根据半数致死量（LD50）数值,判定受试物的毒性分级, 半数致死量(LD50)剂量分级按GB 15193.3-2003附录D执行，凡LD505000mg/kgBW的，可通过，即该菌种可作为生产用菌种或该产品可进行生产、销售。7.2 致病性试验7.2.1 急性毒性试验结果判定同6.1。7.2.2 一次破损皮肤刺激试验如结果为无刺激或仅具轻度刺激作用，可通过；否则，应放弃使用。7.2.3 溶血试验溶血试验结果为阴性的，可通过；否则，应放弃使用。7.2.4 抗菌药物敏感试验受试菌株必须对两种以上的抗生素敏感；否则，应放弃使用。7.2.5 急性腹腔注射致病性试验结果为无急性致病性可通过；否则，应放弃使用。7.2.6 急性眼刺激试验结果对眼无刺激性或具有轻刺激性的，可通过；否则，应放弃使用。附录A（规范性附录）菌种安全分级目录A.1 第一级：免作毒理学试验的菌种A.1.1 根瘤菌类 Azorhizobium caulinodans 茎瘤固氮根瘤菌（田菁（茎瘤）根瘤菌） Bradyrhizobium elkanii 埃氏慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌） Bradyrhizobium japonicum 日本慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌） Bradyrhizobium liaoningense 辽宁慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌） Mesorhizobium huakuii 华癸中生根瘤菌（紫云英） Mesorhizobium loti 百脉根中生根瘤菌 Rhizobium etli 埃特里根瘤菌（菜豆） Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli 豌豆根瘤菌（菜豆生物型） Rhizobium leguminosarum biovar trifolii 豌豆根瘤菌（三叶草生物型） Rhizobium leguminosarum biovar viceae 豌豆根瘤菌（蚕豆生物型） Sinorhizobium fredii 费氏中华根瘤菌（快生大豆根瘤菌） Sinorhizobium meliloti 苜蓿中华根瘤菌 还包括尚未确定种名的，从一些豆科植物根瘤内分离、纯化、鉴定、回接、筛选后在原宿主植物结瘤、固氮良好的根瘤菌，如花生、绿豆、沙打旺根瘤菌等。 A.1.2 自生及联合固氮微生物类 Azospirillum lipoferum 生脂固氮螺菌 Azospirillum brasilense 巴西固氮螺菌 Azotobacter beijgerinckii 拜氏固氮菌Azotobacter chroococcum 褐球（圆褐）固氮菌 Azotobacter vinelandii 棕色固氮菌 Azotobacter paspali 雀稗固氮菌 Beijerinckia indica 印度贝氏固氮菌 A.1.3 光合细菌类 Rhodobacter capsulatus 荚膜红细菌 Rhodobacter sphaeroides 类球红细菌(球形红杆菌)Rhodopseudomonas acidophila 嗜酸红假单胞菌Rhodopseudomonas gelatinosa 胶质红假单胞菌Rhodopseudomonas globiformis 球形红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris 沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas rutila 血色红假单胞菌Rhodopseudomonas sulfidophila 嗜硫红假单胞菌 Rhodopseudomonas viridis 绿色红假单胞菌 Rhodospirillum fulvum 黄褐红螺菌 Rhodospirillum rubrum 深红红螺菌 Rhodospirillum salinarium 盐场红螺菌 Rubrivivax gelatinosus 胶状红环菌（胶状红长命菌） A.1.4 分解磷钾化合物细菌类 Bacillus amyloliquefaciens 液化淀粉芽孢杆菌Bacillus laterosporus 侧孢芽孢杆菌Bacillus licheniformis 地衣芽孢杆菌Bacillus megaterium 巨大芽孢杆菌 Bacillus mucilaginosus 胶胨样芽孢杆菌 Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis 苏云金芽孢杆菌Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 A.1.5 促生细菌类 Paenibacillus azotofixans 固氮类芽孢杆菌 Paenibacillus polymyxa 多粘类芽孢杆菌 A.1.6 酵母菌类 Candida guillermondii 季也蒙假丝酵母Candida membranaefaciens 膜醭假丝酵母Candida tropicalis 热带假丝酵母 Candida utilis 产朊假丝酵母Endomycopsis fibuliger 扣囊拟内孢霉Pichia farinosa 粉状毕赤酵母Pichia membranaefaciens 膜醭毕赤酵母Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 Rhodotorula rubra 深红酵母A.1.7 放线菌类 Frankia sp. 弗兰氏克菌（固氮放线菌） Streptomyces chingyangensis 泾阳链霉菌Streptomyces microflavus 细黄链霉菌A.1.8 AM真菌类 Glomus mosseae 摩西球囊霉 A.1.9 其它 Lactobacillus parabuchner 类布氏乳杆菌 Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌Lactobacillus bulgaricus 保加利亚乳杆菌Lactobacillus casei 干酪乳杆菌Lactobacillus delbruecki德氏乳杆菌Lactobacillus lactis 乳酸乳杆菌Lactobacillus plantarum 植物乳杆菌Pediococcus pentosaceus 戊糖片球菌Streptococcus lactis 乳酸链球菌Streptococcus thermophilus 嗜热链球菌A.2 第二级：需做急性毒性（LD50）试验的菌种 Arthrobacter aurescens 金黄节杆菌Aspergillus candidus Link 亮白曲霉Aspergillus niger 黑曲霉Aspergillus oryzae 米曲霉Aspergillus penicillioides Speg 帚状曲霉Aspergillus wentii Wehmer 温特曲霉Eurotium chevalieri Mangin 谢瓦散囊菌Bacillus brevis(Brevibacillus brevis) 短芽孢杆菌Bacillus circulans 环状芽孢杆菌Bacillus coagulans 凝结芽孢杆菌 Bacillus pumilu 短小芽孢杆菌Bacillus sphaericus 球形芽孢杆菌 Brevibacterium sp. 短杆菌Burkholderia fungorum 真菌伯克霍尔德氏菌Chaetomium cochliodes 螺卷毛壳Chaetomium trilaterale 三侧毛壳Clostridium pasteurianum 巴斯德梭菌Geobacillus stearothermophilus 嗜热脂肪地芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) Geotrichum candidum 白地霉Nocardia sp. 诺卡氏菌Nocardiopsis sp. 拟诺卡氏菌Paenibacillus macerans 浸麻类芽孢杆菌 Penicillium citreonigrum 黄暗青霉Penicillium citrinum 桔青霉Penicillium frenguentans 常现青霉Penicillium glabcum 光孢青霉Pseudomonas fluorescens 荧光假单胞菌Promicromonospora citrea 柠檬原小单胞菌Pseudomonas putida 恶臭假单胞菌Pseudomonas stutzeri 施氏假单胞菌Pseudomonas vesicularis 泡囊假单胞菌Rhizopus oryzae 米根霉Sphingobacterium multivorum 多食鞘氨醇杆菌Sporotrichum thermophile 嗜热侧孢霉Streptomyces albidoflavus 微白黄链霉菌Streptomyces fradiae 弗氏链霉菌streptomyces griseospiralis 灰旋链霉菌Trichoderma harzianum 哈茨木霉Trichoderma koningii 康宁木霉Trichoderma viride 绿色木霉A.3 第三级：需做致病性试验的菌种Acinetobacter calcoaceticus 乙酸钙不动杆菌 Acinetobacter baumannii 鲍氏不动杆菌 Alcaligenes denitrificans 反硝化产碱菌Alcaligenes faecalis 粪产碱菌 Alcaligenes xylosoxidans 木糖氧化产碱菌 Bacillus cereus 蜡样芽孢杆菌 Enterobacter agglomerans 成团肠杆菌 Enterobacter cloacae 阴沟肠杆菌 Enterobacter gergoviae 日勾维肠杆菌 Pseudomonas alcaligenes 产碱假单胞菌Pseudomonas diminuta 缺陷假单胞菌Proteus sp. 变形菌 A.4 第四级：禁用菌种Erwinia sp. 欧文氏菌 Klebsiella pneumoniae 肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella oxytoca 产酸克雷伯氏菌 Pseudomonas aeruginosa 铜绿假单胞菌