《环境毒理学概论》实验教案.doc

环境毒理学概论实验教案孟庆俊，张明青中国矿业大学环境与测绘学院20083实验一 鱼类回避试验一 目的与要求1学习鱼类回避反应的生物学机理；了解回避装置的结构，设计原理及使用方法；掌握回避试验的操作步骤及试验结果的计算和分析。2实验前要求学生预习实验指导书的内容，对整个实验过程要熟悉，要有整体概念，充分理解实验原理。二 实验的组织安排1由于学生人数较多，本实验共分两次进行，即每次一个班，每班分4组。2进入实验室后，先由教师对实验的原理等内容进行讲解，告之实验已准备的相关内容、学生要做的主要工作，以及实验中应请注意的有关事项。然后才能按部就班地进行实验。三 实验原理鱼类回避反应属于行为毒理学的研究范畴，它阐明水生动物对污染物是否回避，及其引起回避的浓度，以期对水体污染进行早期预报，并为制定和评价渔业水质标准提供重要依据。 本试验以鱼为试验动物进行回避试验。鱼类的嗅觉、味觉、视觉、和侧线等感受器对环境刺激具有保护性的本能反应，即回避反应。利用鱼类对受污染水产生回避反应的特点，认为世界污染水区和非污染水区的迷宫回避装置，给鱼以污染物刺激，鱼能主动躲避污染水区，迅速游向清洁水区，据此观察污染物对鱼的回避行为影响。四 实验准备（一）器材与试剂按照实验指导书准备相关实验器材，主要是Y型回避装置，并配制相关化学试剂。（二）实验生物从市场提前一周购买实验用鱼，可以是当地可以见的任何一种鱼，但不应过大，体长在4cm左右即可，在实验室内驯养，以备实验所用。五 步骤和方法（一）预备试验这部分内容由实验教师在学生的正式实验前来完成，主要的目的是确定实验浓度范围。具体的步骤如下：1. 按鱼类急性毒性试验方法，求出待测物的96hLC50值。本实验以资料中查得的96hLC50值为参考。鱼类对铜是非常敏感的，因此实验所选的受试化合物为硫酸铜。2. 选用不同的鱼种，以1/2和1/10 96hLC50 为试验浓度，进行探索性的回避试验，确定试验用敏感鱼种和试验浓度范围。3. 调节供水系统的流量4. 用24支20L的下口瓶构成可调的自供水系统。以活动夹调节水流速度，用液体流量计测量水流量，使水流量为200400ml/min。（三）回避试验步骤1. 试验槽全部注入清洁水，将试验鱼（110尾）移入槽中，让其在槽内适应1530min。2. 关闭供排水系统，将试验鱼全部驱入混合区，配置所需浓度的待测物。3. 观察于记录目测计数，观察污染物对鱼的回避行为的影响，打开供排水系统，移去隔板，每分钟（或每30s）监视和记录一次进入清洁区和污染区的鱼数。历时2030min。重复四次，每次试验结束后，以清水洗净试验槽，间隔15min后，再行重复试验（即每一试验浓度重复四次，即两槽各注入待测液，二次清洁水）。然后更换待测物的浓度。六 结果和报告实验结果后一周内要把实验报告交至实验室，报告书中要重点写明实验的原始数据、实验数据的处理过程与结果，实验结论与讨论等内容，字迹清楚，条理分明。七 注意事项1试验鱼需预先在实验室条件下驯养一周，且为健康鱼种。2必须保持实验室环境的安静，有恒定的温度和均一的光照条件。3严格控制槽中清洁水和试验待测溶液的流速。4试验应按由低浓度到高浓度的顺序进行。每个浓度试验结束后在更换浓度试验时，都必须用清水洗净回避装置。5当待测物浓度低时，须先配成母液备用。6如待测物易挥发，试验时应在回避装置上加盖，以免挥发，影响试验液浓度。7记录时，进入回避槽混合区的鱼，不予记录和计算。实验二 污染区沉积物对水生动物的急性毒性试验（鱼类急性毒性试验）0.0028-2.8mg/L一 目的与要求1通过本实验，熟悉和掌握急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和报告等全过程。2做好实验预习工作。二 实验的组织安排1实验生物的准备及相关的预实验由实验室教师来完成。2学生实验分两次进行，一次一个班，每班分10个组。3进入实验后，先由教师简单讲解实验原理、过程与注意事项，并说明实验生物的准备与驯养过程。然后再开始正式的实验。三 实验原理鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24小时，最好以96小时为一个实验周期，在24、48、72、96小时时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物的浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占有重要地位。考虑到污染沉积物的取样难度，本实验采用金属铜作为受试物，测定其对鱼类的急性毒性。四 实验准备1实验鱼的选择与驯养试验用的鱼必须对毒物敏感，具有一定的代表性，便于实验条件下饲养，来源丰富，个体健康，我国可采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼(青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼)、金鱼、鲫鱼等。本实验选用草鱼作为实验鱼。选用的试验鱼在试验前必须在实验室内以过驯养，使这适应实验室条件的生活环境，至少驯养7天。驯养期间应每天换水，喂食12次，但在试验前一天应停止喂食，以免影响实验结果。驯养期间试验鱼死亡率不得超过5%。2实验仪器设备相关玻璃器皿。主要是1L的玻璃烧杯。五 操作步骤1预实验用于确定正式实验所需浓度范围，由实验教师在学生正式实验前完成。2正式实验:根据预实验的结果，在包括使鱼全部死亡的最低浓度和96h鱼类全部存活的浓度之间至少设置5个浓度组，并以几何级数排布。每个浓度组至少设23个平行，每一个系列设一个空白对照。试验鱼的数目以每组实验浓度1020尾合适.在24h、48h、72h、96h后检查受试鱼的状况。如果没有任何肉眼可见的运动即可判断鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。试验结束时，对照组的死亡率不得超过10%。六 实验报告1数据处理计算出24h、48h、72h、96h的半致死浓度(LC50)值，并计算95%的置信限。依据LC50值的大小和下表标准，确定铜对鱼的急性毒性分级。鱼LC50值(mg/L)10000毒性分级剧毒高毒中等毒低毒微毒2编写报告在实验报告中应包括试验名称、目的、试验原理、试验的准确起止日期。还有如下几项：(1)试验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯化状况。(2)受试物质的名称、来源、物化性质和保存方法。(3)实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。(4)实验溶液的浓度与配置方法、实验温度。(5)实验条件(6)实验开始后24h、48h、72h、96h的半致死浓度(LC50)值，及其毒性分级。(7)实验结果讨论等。七 注意事项1生物材料选择上应尽可能选择敏感种，其年龄，大小应尽量一致。2试验期间，对照组鱼死亡率不得超过10%。3试验宜在控温室中进行，并保持一定的光强度。实验三 重金属对鱼肝过氧化氢酶的影响一 目的与要求学习应用生物化学方法研究污染水体中重金属对鱼类的影响，掌握生物监测的一个测试手段。二 实验的组织安排1实验前由实验室内的教师准备购买实验用鱼、进行室内染毒处理及相关器皿和化学试剂的准备。2两个班同时进行实验，4-6人一个小组。但由于实验历时较长，操作较复杂，要求安排时间上要找整块的时间，如一个下午。三 原理过氧化氢酶普遍存在于动物、植物和微生物细胞中。它催化分解细胞代谢产生的H2O2和还原某些其他氧化物。在调节细胞免于死亡过程中其重要作用。过氧化氢每含有丰富的疏基，重金属可与酶的疏基活其他活性基团相互作用，从而改变酶的活性，呈现致毒作用。过氧化氢酶催化分解H2O2，以H2O2消耗量来表示过氧化氢酶的活力。酶活力测定原理如下：2 H2O2 O2 + 2 H2O剩余的H2O2用碘量法定量测定：H2O2 + 2 KI + H2SO4 I2 + K2SO4 +2 H2OI2 + 2 Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6四 设备与材料（一）设备 1 玻璃匀浆机；2 解剖器具；3普通台式分离机；4定时钟；5 恒温水浴；6滴定管（10ml，酸式）；7 碘量瓶（100ml）。（二）试剂1）0.5mol/L H2SO4；2）10% KI；3）0.01g/L Na2S2O3 ；4）0.01 mol/L，PH6.8磷酸缓冲液：A称取1.3610g的KH2PO4溶至1000ml，B称取3.5816g的Na2HPO4溶至1000ml，取A与B大致同体积配成PH6.8的磷酸缓冲液；5）H2O2磷酸缓冲液：取1ml 30%的H2O2试液，用0.01 mol/L，PH6.8磷酸缓冲液稀释至1000ml；6）淀粉指示剂：取0.3g可溶性淀粉，以少量冷蒸馏水拌匀，倒入沸水中，冷却后，加入0.1g的Na2CO3，用蒸馏水稀释至50ml；7）1%鉬酸铵溶液；8）0.25 mol/L蔗糖溶液。（三）实验材料处理测定重金属离子对鱼96hLC50值，再以1/21/6 LC50浓度的重金属离子试液，将实验用鱼在试液中暴露96h。五 步骤和方法（一） 酶匀浆制备将处理后的鱼杀死，剥离肝脏，用滤纸吸干，称重，按1:10（W/V）加入14冷0.25mol/L蔗糖液，匀浆，以1500r/min离心5min，取上清液，用0.25mol/L蔗糖稀释20倍，置于14环境中，供测定酶活力使用。（二） 过氧化氢酶活力测定 过氧化氢酶活力测定操作程序表 测定组 试剂试剂空白组处理组对照组0.01mol/L PH6.8H2O2磷酸缓冲液5ml5ml5ml25水浴中恒温1分钟2ml 0.5mol/L H2SO41ml酶液1ml酶液25水浴中准确保温3分钟（混匀）1ml酶液2ml 0.5mol/L H2SO4(破坏酶活性)2ml 0.5mol/L H2SO410% KI0.5ml0.5ml0.5ml1%钼酸铵1滴1滴1滴混匀后放置3分钟，用0.01g/L Na2S2O3 滴定，达浅黄色时，加淀粉23滴，滴定至蓝色消失。六 结果和报告（一）过氧化氢酶活力以单位时间酶促分解H2O2 的微克分子数表示。计算公式如下：酶活力=A处理组样品消耗的Na2S2O3（ml）。B对照组样品消耗的Na2S2O3（ml）。C试剂空白消耗的Na2S2O3 （ml）。3反应时间3分钟。2消耗2个分子的Na2S2O3相当于1个分子的H2O2。F酶液的稀释倍数，本实验为200。NNa2S2O3的当量浓度（g/L）。1000毫克分子换算成微克分子的放大倍数。（二）过氧化氢酶实验记录表格试剂空白（C）处理组（A）对照组（B）123123456123456消耗的Na2S2O3（ml）fN (g/L)酶活力说明 记录人_七 注意事项1实验用鱼应选择规格相近的同种同龄鱼。2测定过氧化氢酶活力的鱼样品数不得少于6条。3整个酶活力测定操作过程应在低于25室温下进行。酶促反应必须在25恒温下进行。4酶促反应时间必须计时准确。5滴定消耗0.01g/L的Na2S2O3在6ml左右为合适。超过或低于此值，应调节稀释倍数。6实验记录表中，“酶活力”以下的记录项目，只对处理组和对照组适用。“说明”一栏可记录中毒试剂的浓度，或其他相应的实验条件，以及在实验中出现的意外情况。实验四 氟化物对植物的静态熏气染毒试验一 目的与要求通过试验掌握气态污染物对植物毒性的染毒过程与方法，观察大气中氟化氢对典型植物的毒害症状。二 实验的组织安排1实验前学生根据植物对氟化氢的敏感程度，在校园里自己采集植物样本。其它仪器与试剂的准备由实验室教师完成。2两个班同时进行实验，4-6人一个小组。三 实验原理随着我国经济的发展，工业、农业生产、日常生活和交通运输向大气中排放的污染物的数量和种类日益增加，这些大气污染物直接或间接危害着植物。其中大气中氟化物污染造成的危害情况日趋严重，目前，酸雨、温室效应和臭氧层的破坏是现在世界范围内的三大问题，而大气中的氟化物与这三个问题都密切相关，有关大气中氟化物污染方面的研究也成为当前环境科学研究的重要内容，引起了人们的广泛重视。通常情况下植物体内也含有一定量的氟，但当植物体内氟含量超过植物所能承受的量时植物就会受到伤害。因此，大气中的氟化物超过一定量时就会对植物造成伤害。而氟化氢是毒性较强的大气污染物之一，这类污染物在空气中的浓度为1ppb到数十个ppb时即产生危害。而且氟化氢是能引起酸性危害的污染物。氟化物对植物的外型和生长发育产生直接影响外，还产生间接影响影响，主要表现为植物生长减弱、降低对病虫害的抵抗能力。当大气中氟的浓度超过110-9时，就能在植物体内富集，通过食物链危害人体健康。它对植物的毒性比二氧化硫要大，在同一浓度下，氟化氢的伤害比二氧化硫要大10倍以上。氟化氢对植物危害的毒理主要在于它与叶片中的钙质发生反应形成氟化钙，干扰酶的作用，并阻碍植物正常的代谢，破坏叶绿素与原生质，使细胞失水而枯萎。空气中的氟化氢对植物的危害具有积累性的特点，即使空气中氟化氢的浓度很低，也能被叶片吸收，并不断累积。当叶片中氟的数量积累到一定限度时，就要出现伤害症状。氟化氢还有使植物叶片褪绿和过早落叶现象，使生长受到抑制，对结实过程也有影响。氟化氢对花粉粒萌发和花粉管伸长有抑制作用。氟污染还能使成熟前的桃、杏等果实在沿缝合线处的果实过早成熟软化，降低产量。氟化氢对植物的急性危害症状表现为：伤斑出现的部位主要分布在叶尖和叶缘，氟化氢经气孔进入叶内后，首先溶解在叶内的组织液中，然后转移至叶尖和叶缘。当累积至一定程度后，就要干扰酶的活性，阻碍代谢活动，使叶肉细胞发生质壁分离和萎缩。这时叶尖和叶缘发生坏死现象，逐渐变成褐红色，呈现特异的灼烧状。有的植物受氟化氢危害时，最初在叶尖和叶缘出现水浸渍状，再渐渐变成浅黄白色，最后变成褐红色伤斑。另外，在受害的叶片上，健康组织（绿色部分）与坏死组织（伤斑部分）之间形成一条明显的红色或深褐色的分界线，坏死组织逐渐枯死。严重受害时，伤斑还可从叶缘向较大的叶脉之间发展，并向叶基部展延。水稻和小麦受氟化氢受害时，先在新叶的尖端和边缘出现褪绿黄化现象。特别是抽穗前后的剑叶和幼穗的顶部最为敏感，常很快出现受害症状，由绿变为灰绿。当氟化氢的浓度增高时，叶尖、叶缘的伤斑迅速扩展，甚至几小时内就使叶片变成褐色或黄白色，几天后就要枯萎。对氟化氢敏感的植物有油菜、田芥菜、西风古、燕麦草、秋水仙、卖瓶草、墙生藜、繁缕、鸢尾草、水仙、萱草、风信子、唐菖蒲、鸭茅、马兰、铃兰、美人蕉、仙客来、沙列布、郁金香、杏树、梨树、桃树、枣树、，欧洲鹅耳枥、德国鸢尾、樟叶槭、细子龙、阿尔卑斯忍冬、松树、杜鹃、落叶松、金丝桃、枫以及禾本科、蓼科、藜科、石竹科、蔷薇科、葡萄科、百合科、羊茅科、黄花茅属植物等。对氟化氢抗性强的植物有苹果树、柑桔树、芒果树、海桐、麻疯树、构树、山茶、女贞、阴香、大叶紫薇、牛乳树、细叶榕、菩提树、十字花科和菊科植物等。四 设备与材料（一）设备烘箱，微量注射器（10.0、5.0ml各一只），聚乙烯塑料瓶（100、50ml），玻璃钟罩，60目筛、培养皿、陶瓷研钵、容量瓶（1000ml、500ml、250ml）、聚四氟烧杯（50ml）（二）试剂40%氟化氢溶液（分析纯），用于配制熏气的氟化氢溶液。（三）材料在校园中现场采集受试植物的带叶枝条，根据对氟化氢的敏感程度，分别采集适量的敏感植物与抗性植物至少各一种，一部分用于氟化氢熏气，一部分作为对照。五 实验过程1静态熏气采集待测植物带叶枝条，于三角瓶中以清水供养，分放于两个大钟罩中，置于日光灯下，另准备二个培养皿，内放9cm滤纸3-5张，一个滴入蒸馏水5ml，另一个滴入5mlHF溶液，立即分放于二个钟罩内，在光照下放置1-2h，然后打开钟罩，根据试验需要，不加清洗或用去离子水快速清洗后，取部分叶片在60-80。C烘箱钟充分干燥12-48h（随植物组织性质而定），待测。2观察植物的受害症状，并将枝条上剩余的其他叶片留下，过24h观察后续植物的伤害症状。六 结果和报告观察植物样品的受害症状。植物名称 症 状 样品来源 报告人：七 注意事项1样品分析是一项要求严格而细致的工作，烘样品温度控制在80摄氏度以下，粉碎后摇充分均匀。2熏气浓度的合理选择与控制是本实验的重要因素，应注意钟罩的密闭程度，正确操作。实验五 植物中氟化物含量的分析一 目的与要求学习用酸提取，离子选择电极法测定植物中氟化物的方法，熟悉和掌握操作步骤及实验结果的计算、数据分析，写出相应的报告。二 实验的组织安排1实验的仪器与器皿、试剂由实验室内教师完成。2两个班同时进行实验，4-6人一个小组。三 原理氟在植物中以易溶的无机盐形似存在，用酸或碱都可以从植物中提出氟离子，在常温下，用稀HCl、H2SO4、HNO3、HClO4等均可提取植物中的氟离子。本实验采用酸浸提，离子选择电极法，适用于样品中可溶性氟化物的测定。一氟化镧电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极，当提取液中存在氟离子时，在氟电极上产生电位响应。工作电池表示如下：AgAgCl，Cl-，F-LaF3 试液饱和甘汞电极当溶液中总离子强度为定值时，电池的电动势E依能斯特方程随待测液中氟离子浓度变化而变化。E=E。-LgCF-E与LgCF-成直线关系，2.303RT/F为该直线的斜率（25时为59.16）。与氟离子形成络合物的多价阳离子如F3+，Al3+及SiO32-干扰测定，用总离子强度缓冲液消除干扰离子及酸度影响。氟离子选择电极法最低检出浓度为0.1g/ml。四 设备与材料 （一） 仪器1. 氟电极，饱和甘汞电极 2. PXD-12型数字式离子计（或其他高精度数字式离子计。此外，也可用PHS-2型酸度计目测读数）3. 磁力搅拌器合磁性搅棒4. 振荡器5. 植物磨粉机6. 微量注射器（0.25ml）7. 聚乙烯塑料瓶（500，100，50ml）8. 自动加液器（10，5ml）（二） 植物材料 在氟污染区或人工熏气罩钟处理的供试植物与清洁区采集的同种植物及其同位叶，根据试验需要，不加清洗或用去离子水快速清洗后，在6080烘箱钟充分干燥1248h（随植物组织性质而定），磨粉，过60目筛，分装于塑料瓶中待测。五 步骤和方法（一）试剂配制1制去离子水：测氟过程中所用的水均用去离子水。2提取液：0.1N HClO4-13ml（7072，AR）HClO4稀释至1L:或0.5N H2SO4-14ml（比重1.84，AR）H2SO4稀释至1L，任选一种即可。3总离子强度缓冲液（TISAB）：柠檬酸钠-硝酸钾溶液：147g柠檬酸钠（Na3C5H5O7H2O）和50gKNO2，溶解后稀释至1L。4氟标准贮备液：称优级纯氟化钠（预先在105，烘2h）2.2105g，用去离子水稀释至500ml，此溶液每ml含氟200ppm，冰箱保存。（二） 称样及提取称样前，振摇装样品的瓶子，充分混匀，称取100-500mg（视含氟量高低而定）。置于50ml塑料瓶中，加10ml酸液，于振荡器或搅拌器上提取20min，提毕，加10ml缓冲液，待测。（三）测定 可采用标准曲线法和 标准加入法任选一种进行测定 。1. 标准曲线直接测定（1） 配置工作液：将氟标准液自冰箱中取出，放至常温。吸取1ml，即为10ppm/ml的工作液。（2） 标准曲线制作：取5个50ml的容量瓶，依次放入工作液1、2、3、4、5ml，加10ml硫酸和10ml缓冲液，用去离子水定容至刻度，即为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ppm/ml的氟标准液系列。（3） 测量：标准液浓度由低到高依次倒入50ml塑料杯中，将已漂洗到空白电位值（-320mv）的 F电极，用滤纸轻吸水分，与参比的甘汞电极插入溶液中，在中速搅拌下，12min电位达到稳定（在低浓度F溶液中，电极的响应时间比高浓度的略长），测得mv值E。（4） 作图：在半对数坐标纸上以电极电位位横坐标，氟浓度为纵坐标绘制E-logCF曲线。（5） 样品测定：将取好的待测液定容到50ml，按（3）进行测定，读取mv值E，在标准曲线上找到相应的氟量。（6） 计算C C样品的含氟量（ppm）； A标准曲线上查得得样品含氟量（ppm）； W样品干重； V提取液总量。2.标准加入法不用制作标准曲线，只要已知电极斜率及测定时得溶液温度，直接对提取液进行测定。 步骤：将（二）提取得样品液放在搅拌器上插上氟电极和参比电极，电位稳定后读得mv值E1，用微量注射器注入200或100g标准氟溶液，读得mv值E2，根据以下公式进行计算：CC样品得含氟量（ppm）M加入得标准氟量（200或100g）W样品干重gE2-E1S-电极斜率，斜率符合Nernst公式时则S0.1984T若测定时溶液得温度t为20，则S0.1984（273+20）58.13或用实测斜率方法对S进行实测。六 结果和报告样品分析结束后，根据叶片含氟量写出报告，比较污染区与清洁区（或实验室静态熏气试验中的污染组与对照组）同种植物的含氟量的多寡，说明环境污染的程度和叶片吸收氟的能力和速率。 植物含氟量的分析报告植物名称 样品来源 测定方法 测定日期 分析结果植物样品编 号 含氟量（ppm）污染组对照组 12 3分析说明： 报告人：七 注意事项1.样品分析是一项要求严格而细致的工作，烘样品温度控制在80以下，粉碎后摇充分均匀2.电极的斜率与温度变化有关，被测液与标准液应在相同的温度下测定为宜，温度变化1，可导致氟的浓度误差0.83.测定一个样品后，用去离子水冲洗粘着在电极上的污物，再在清洁水中漂洗半分钟，再测下一个样品。4.为避免交叉污染，缩短洗电极的时间，应从低浓度到高浓度依次测定，在高浓度氟溶液中，电极会出现迟滞效应，必须花较多时间漂洗才能校正到空白电位值，也可先用PH 3的稀酸浸洗，然后用去离子水漂洗，可缩短漂洗时间。5.在测未知样品时，最好同时测一个已知浓度的参准样品，用来检验标准曲线及所用提取液，缓冲液等是否合乎要求，以便校正。6.电极用毕，用去离子水漂净后贮与1ppm的低氟液中，长时间不用可干放，使用前在去离子水中浸润，使用时校正空白值在320mv以上（也可依电极出厂要求洗至空白值）才可使用。