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生物工程下游技术实验讲义溶菌酶分离纯化综合性实验 主编 周林 广东药学院生命科学与生物制药学院生物技术系2007.6序实践是人类获得知识的重要途径。对于自然科学来说，实践主要通过观察和实验来进行。实验对于巩固理论教学中的基本原理，培养学生的独立动手能力，提高分析和认识问题的能力等具有十分重要的意义。在提倡素质教育，提倡创新的现代社会中，更是如此。以下要求主要是针对进行生物工程下游技术的实验教学的学生编写的，但是对其他实验课程的教学也有一定的参考意义。一、珍惜实验课的机会 从根本上说，实验课指导老师给学习生物工程下游技术的学生开设的综合性实验课与真正的科学研究实验有着基本相同的过程，但是又有一定的区别。一般来说，学生实验只要遵循正确的操作过程，都会得到明确的结果。这与真正的科学实验中要不断探索方法而又经常出现失败的情况是不同的。实验课的目的是教学，使学生在有限的时间内掌握一定的实验方法。通过自己亲自动手，进步理解实验背后的基本理论，并培养实事求是和客观严谨的科学实验素质，这是任何理论课难于达到的。有幸参加实验课的学生应当珍惜这种机会，因为不仅前人长期的探索提供了所要进行的实验的方法，实验课老师也为实验课投入了大量时间进行准备，同时学校和老师要为之准备来之不易的试剂、仪器和各种实验条件。在你的学习生涯中，能有幸在实验课堂上亲自动手实践的机会能有多少次呢。 其次，实验课上的学习内容将为你今后的科学生涯打下宝贵的基础。实验课上的内容，尽管很多是验证性的，真正探索性的实验很少，但实际上仍是前人探索过程的重复，只要你肯动脑筋，你会从一个重复性实验中领会到前人为什么这样设计实验、为什么这样操作、为什么这样理解和判断结果，这与你今后进行未知世界探索的科学实验从认知论上看是基本相同的，因而能培养你科学的研究思路。另一个方面科学实验不是一种个人的随意活动，进行科学实验时是不依规矩则不能成方圆的。前人为更有效地进行科学实验总结了很多原则、规定、程序、标准以及统的实验术语，有些适合于所有的自然科学实验有些则是专为本实验所设定的，对这些的了解和掌握，都是以后你在科学探索上登堂入室所必备的基本功：比如实验室安全规则，实验中度量衡单位的确定，基本仪器的使用规则，生化试剂的保存要求，实验室资料的处理，实验原始记录的书写，实验结果的统计学分析，书写实事求是、清晰规范的实验报告等，以上这些，对于有效的科学实验是非常重要的，而只有到实验室并亲自动手实践，你才能真正了解掌握并长久的记忆。二、进入实验室前必须有所准备“凡事预则立，不预则废”。如果你对要进行的实验在毫无准备甚至一无所知的情况下走进实验室，你将受益很少，甚至会遇到麻烦，比如发生安全事故。实验课老师的建议是，你在实验课前准备越无分，则越有可能取得实验成功，且受益越多，你应当事先预习实验课内容，了解实验的目的和将要采用的方法，并将其与理论课的学习联系起来。在开始实验之前从老师那里了解可能山现的安全问题以及应采取的措施；进入实验室时你应当带上实验教程及有关资料以及实验记录本，还有本实验中可能用到的其他用具，如直尺、记号笔。对于实验安全也必须充分注意，如易燃、易爆、具化学毒害性物质，仪器损坏及伤人事故，水、电事故等，具体细节很多，归纳一点，走进实验室的一刻就要“提高警惕、保证安全”。三、从原始记录到实验报告 实验课的一个非常重要的内容是训练学生怎样进行实验原始记录以及怎样完成从原始记录到提交实验报告的过程，这对于学生今后从事科学实验是一个极其重要的基本功训练。虽然教学实验课的实验记录和提交实验报告与真正进行探索性科学实验和写作科研论文有一些明显的区别，如前者是在教师指导下按部就班地进行，可能出现的复杂情况、困难程度以及工作量都远远小于真正的科研探索实验，但是从培养训练的角度来看，它是一种真正科学实验的演习，因此要求学生进行实验记录和提交实验报告应当达到探索性科研时同样的要求。 首先学生要认识实验原始记录本的重要性，它是科学研究最重要的工具之一，手边没有笔记本和笔就不要开始做实验。实验记录应具有真实性、现场性、完整性和连续性。原始记录的一条原则是越详细越好，训练有素的科学工作者都知道“常规程序中发生的最微小的差异，和任何出于意料的现象样，不管当时看起来它是多么地不相干，它都是一件值得注意、值得记录下来的事情”。可能被一个初学者看成微不足道的细枝未节，往往是整个实验最重要的方面。实验记录本必须装订结实，有页码，有日期，纸张结实，墨迹明显，记录中不应留任何空白页。 原始实验记录（实验报告）的内容： 1实验的标题和记录人员； 2实验的日期、时间以及地点； 3实验者预先设想的目标（实验目的）： 4本实验所用方法： 5实验原理； 6重要仪器的参数及测量情况，注意记录合理的有效数字； 7重要外界因素的记录(例如实验的温度、气压、天气状况)： 8不常见的或者不熟悉的仪器设备的描述； 9有关试剂和材料信息(如名称，等级)一切非商品材料的来源；一切原材料或试剂的提纯或试验所用的方法和结果；一切可能影响实验的偶发性事件，如停电、接电话中断实验等。不正常的操作以及数值和观察结果应当及时在记录本上说明，不要试图依赖记忆。 10仪器测出的原始图表与记录粘在一起，不要另外保存。 根据实验的复杂情况，有时候在实验完成之后可在另个记录本进行第二次记录，第二次记录的目的是在保留原始记录真实性的基础上使记录更加条理化更加简洁清晰。实验的第二次记录本将用于同指导老师讨论结果，并为写实验报告或学位论文做准备。抄写一个二次记录，会使你再次考虑原始记录中可能的细节并提供了一个副本以防丢失或损坏。然而，这些记录应保留原始记录的基本特征并更加简明。如果方法是由书本或论文中引用的提供一个出处即可。进行第二次记录时，要用一种更清晰的方式表示数据，如平均值表格或总结性图表，要用适当的统计检验分析实验结果。 实验完成以后必须提交一份实验报告。实验报告对于实验者本人是一个非常重要的实验结果的总结，对于教师是一个了解学生实验完成情况的依据。写作实验报告对于学生今后写作科研论文是一个非常有意义的训练。实验报告的写作过程是一个对实验结果分析归纳、去粕取精、去伪存真、把感性认识上升到理性认识的过程，实验报告除了以上提到的内容，还要包括实验结果和讨论。实验结果一般按照实验的实际进行过程分层次地介绍实验结果。一般用图表来直观地将实验结果展示出来，必要的仪器测试图谱要用原件附在文中，所有的图表要有清晰的说明。要从实验结果中恰如其分地推出结论，对于实验结果中一些非正常的难于解释的结果一定不要忽略。讨论部分主要对实验结果进行分析，讨论结果的意义和重要性，以及结果中一些特殊现象的解释，与其他人的结果进行比较，提出实验中存在的问题以及下一步的计划。要求大家在这一部分能总结实验的得失，提出自己的一些看法，如果说其他部分的记录和写作相对严格，这一部分则是充分展示个人思想和特色的窗口。此外，要记录同组的实验成员，并感谢那些在工作中给予过帮助的人。如果在方法和讨论部分涉及到参考文献，必须给出参考文献的信息。这既是对他人工作的尊重，也是自己写作的依据。在写作实验报告的过程中，要充分利用目前常用的电脑软件，如图表处理软件、统计学分析软件，使实验结果准确、清晰地呈现出来。内容说明根据生物工程下游技术课程的核心理论内容，即目标产品的分离、纯化。我们设想完成目标产品从粗分离到纯化的综合实验。考虑到学生操作的难度、学时安排和实验衔接，设计了溶菌酶分离纯化综合性实验。本综合实验讲义参考了生物工程技术试验指导(高等教育出版社，魏群主编，2002年第一版)中关于溶菌酶的部分实验。但是内容体系和实验方法有很大不同。如采用等电点沉淀法进行样品的预处理；在离子交换层析实验中采用动态分离过程取代传统的静态吸附过程，并用一步柱层析法进行了溶菌酶的纯化。课程老师利用06年暑假和周末时间进行了大量的预实验，才使讲义得以付梓。生科院实验中心的各位老师和学院领导也给予了大力支持，这里一并感谢。欢迎各位同学提出宝贵的意见以便进一步的修改。目 录第一部分 实验背景知识一 蛋白质分离纯化的一般程序二 溶菌酶第二部分 实验部分实验一 层析柱装填及柱效测定实验二 溶菌酶粗提取实验三 蛋白质标准曲线的制作实验四 溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定实验五 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定第三部分 附录一 层析仪使用说明二 分光光度计的使用三 SDS-PAGE电泳四 凝胶成像系统的使用第一部分 实验背景知识一、蛋白质分离纯化的一般程序1. 考虑分离纯化的要求蛋白质的分离纯化首先要考虑其应用，即蛋白质是用来做什么的，进而决定对蛋白质分离纯化的要求。不同的应用对蛋白质的要求不一样。比如：在数量上，用于研究目的的蛋白质可能只需微克级别，而工业和医药用途的蛋白质则可达到千克级别。从纯度标准要求上看，临床用蛋白质其纯度一般要求在98%以上，工业用途纯度要求不高，主要是尽可能出去其他杂蛋白。实验室水平的纯化，主要追求对目标产物的高选择性分离，即高纯度；而在规模生产时，则主要追求工艺的简便性、经济性和可放大性，纯度的要求在此前提下实现。2. 建立相应的检测手段建立满足要求的检测方法，是评估纯化方法，判断蛋白质产率、活性、纯度的前提。对于检测方法，则要求：灵敏、专一、精确、简便。对生物大分子的检测，主要评估几个方面：活性、纯度以及浓度。活性检测：一般依据其催化特异性底物的反应进行。总的要求是快速、简便、准确。一个好的测活方法的建立，是整个纯化工作成功的一半。如：蛋白激酶常用其催化底物与P32-ATP的反应进行检测，超氧化物歧化酶（SOD）的活性通过邻苯三酚法进行检测。纯度检测： 常用于蛋白质纯度检测的技术包括：电泳、HPLC、离心、免疫化学法、生物测定法、分光光度法等方法。如果在相应的方法达到了单一的区带、斑点或只有一个吸收峰，我们可以认为该蛋白质达到了相应方法的纯度，如电泳纯、色谱纯。测定蛋白质纯度是一项艰巨的工作。杂质的含量往往低于很多常规的分析方法的检测极限。因而往往一种方法检验所得的结果认为是纯的，换另一种更灵敏的方法就发现不纯了。一般一种方法检测纯度并不可靠，故常采用两种或以上的方法来检测纯度。但需注意的是蛋白的纯度是化学和物理学的概念，与蛋白质所具有的生物活性有着更复杂的关系，蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大影响其生物活性，而这些因素有些往往是用一般纯度检测方法查不出来的。浓度检测：浓度检测是评估产率的一个重要因素。利用蛋白质浓度检测方法即可进行，比如：凯氏定氮法、Lowry法、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法等。双缩脲法：蛋白质含有多个肽建，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色化合物，可在540nm处比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。测定范围在110mg/mL。此外，Cu2+与蛋白质形成的复合物也可以在310-330nm测定，比540nm处测定灵敏10倍以上。Lowry法：是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。在750nm比色或500nm比色测定。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。紫外吸收法：大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.10.5mg/mL含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：浓度（mg/mL）1.45A280-0.74A260此外，蛋白质的肽键在200250nm有强的紫外吸收，其光吸收强弱在一定范围内与浓度成正比，且波长越短光吸收越强。选取215nm可减少干扰和光散射，用215和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差。该测定范围在20100g/mL。计算公式为：蛋白浓度（mg/mL）0.144（A215-A225）考马斯亮蓝G-250法：考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。该法反映快，操作简便，消耗样品量少。测定范围0.011.0mg/mL。3. 原料的选择通常，为了使得分离纯化过程容易进行，减少生产成本，总是选择含目的蛋白质丰富的原料。同时也要考虑原料来源、取材方便经济等因素。例如：在分离超氧化物歧化酶（SOD）时，尽管在动物的肝、肾、心等器官内含量十分丰富，而血液中含量较少，但考虑取材容易、价廉以及预处理方便等因素，在实际生产中还是选择从红细胞中提取。现在，利用动植物细胞体外大规模培养技术，可以大量获得原材料，以用于蛋白质的分离纯化。利用基因工程重组DNA技术，能够使某些在细胞中含量极微的蛋白质的纯化成为可能。如用于药物筛选用的多达300多种蛋白激酶，现均利用体外DNA重组方式大量获得。4. 蛋白质的提取蛋白质提取时首先应根据蛋白质的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。在一定的条件下，用适当的溶剂处理含蛋白质原料，使蛋白质充分溶解到溶剂中。5. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化，均是依据蛋白质分子的不同性质，选择不同的方法进行。一般先依据蛋白质的溶解度性质，选择适宜的方法，将目的蛋白质制得粗蛋白，然后根据蛋白质分子的大小、电荷性质、亲和专一性等，应用离心、层析、电泳、结晶等方法，将蛋白质纯化。对于酶类蛋白质，评价分离纯化方法好坏的指标有两个：一是总活力的回收率，二是比活力提高的倍数。总活力的回收率反映了纯化过程中蛋白质活力的损失情况，比活力的提高倍数则反映了纯化方法的效率。纯化后比活力提高越多，总活力损失越少，纯化效果越好。所谓酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位定义为：在一定条件下，一定时间内，将一定量的底物转化为产物所需要的酶量，酶活力的大小即酶含量的多少。通常用最适条件下酶所催化的某一化学反应的反应速度来衡量酶活力的大小，所以酶活力的测定就是测定酶促反应的速度，即单位时间内底物或产物的浓度变化。国际单位酶活力单位统一用国际单位（ international unit ，简写为 IU ）来表示，规定：在最适反应条件（ 25 ，最适缓冲液离子强度和 pH 值，最适底物浓度）下，每分钟内催化 1 mol 底物转化成为产物所需要的酶量为一个国际单位，即 1IU = 1 mol/min 。比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位 /mg 蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。酶活力的测定，是通过为酶所催化的反应速度的测定进行的。酶促反应体系复杂，影响酶促反应速度的因素很多，包括底物浓度、酶浓度、产物浓度、 pH 、温度、抑制剂和激活剂等影响因素。酶促反应速度通常用在一定条件下，以单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，用产物浓度对反应时间作图，得到酶促反应速度曲线。从酶促反应速度曲线可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，由于底物浓度降低，产物反馈抑制，逆反应速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反应速度逐渐下降，最后完全停止。在测定酶促反应速度时，要避免以上干扰因素，必须在酶促反应初期进行，在最初这段时间内的反应速度称之为反应初速度，在过量的底物存在下，反应初速度与酶浓度成正比。在酶促反应速度曲线上，过原点做切线，其斜率即为初速度。酶促反应速度的单位是：浓度 / 单位时间。表2是采用表格记录的酶的纯化过程的例子，从表中可以看出，1000mL的除提液，总酶活5000u，经5步纯化，最终获得4mL的纯酶，酶活从原来的0.416u/mg至500u/mg，纯度提高1200倍，酶活力从原来的5000u减至1500u，产率为30。通过纯化倍数和活力回收可评价一个制备工艺的优劣。 表2 酶的提纯过程记录格式（模拟的数据）步骤总体积 Ml蛋白浓度mg/mL蛋白总量 mg酶浓度 u/mL比活力 u/mg总活力 U产率 %提纯倍数除细胞粗提液100012120005041650001001.050热变性除杂蛋白100088000480604800961.44硫酸铵分级沉淀25037501103672730558.83离子交换层析5735364521820364125亲和层析40.7533755001500301200二 、溶菌酶溶菌酶（lysozyme）是由Alexander Fleming在1922年发现的一种有效的抗菌剂，因能选择性地溶解微生物细胞壁而得名。其全称为1,4-N-溶菌酶，又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G。它能水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1,4糖苷键，破坏肽聚糖支架，低渗溶液中细胞在内部渗透压的作用下胀裂开，引起细菌裂解。溶菌酶主要溶解革兰氏阳性菌的细胞壁，革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接做用。有些革兰氏阴性菌，如伤寒沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌也会受到溶菌酶的破坏。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。在实际应用中, 由于它具有溶解细菌细胞壁的能力，起到抗菌消炎、消肿、镇痛、加快组织修复的作用，被广泛应用于医疗行业；由于溶菌酶本身是一种无毒、无害、安全性很高的高盐基蛋白质，作为天然防腐剂的溶菌酶在食品工业中有广阔的应用价值；此外，还被用于饲料工业、用于提取微生物细胞内各类物质和进行原生质体制备及融合育种等科学研究领域。溶菌酶具有以下特点：l 在自然界中广泛存在，其中以禽类蛋清中含量较高，鸡蛋中占蛋白总量的3.5%；l 碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸比例很高；l 鸡蛋清中溶菌酶由129个氨基酸组成单一肽链，分子量为14.3kd，分子内有四对二硫键，分子呈一扁长椭球体；l 溶菌酶的活性中心为Asp52和Glu35。l 是一种罕见的稳定蛋白质，对温度和酸不敏感，在弱碱性条件下稳定。l 等电点为10.8。鸡蛋清中含1315的蛋白质，除了溶菌酶以外，还有其他的蛋白质，其主要特点分别如下：%PI分子量kd说明糖蛋白卵清蛋白质56.804.745卵转铁蛋白13.706.680类卵粘蛋白11.604.828抑制胰凝乳蛋白酶卵粘蛋白3.153.834.4128胰蛋白酶的抑制剂卵糖蛋白0.55卵巨球蛋白质0.55卵抑制素0.10抗生物素蛋白质0.05与生物素结合黄素蛋白质0.85蛋白质溶菌酶3.501114.3未确定蛋白质9.10根据上表中溶菌酶与其他含量较高的蛋白质等电点的不同，以及溶菌酶本身的特点就可以应用等电点沉淀法除去大部分的杂质，从而得到溶菌酶的粗品。1 溶解菌的来源最初弗莱明发现人的眼泪、唾沫及感冒后的鼻涕里含有溶菌酶。之后研究人员发现鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆，植物萝卜、木瓜、卷心菜等均含有溶菌酶。随着生物技术的发展，人类已经可以采用基因工程的办法来获得溶菌酶。1.1.天然资源的溶菌酶在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中均发现有该酶存在。已知在人的眼泪、鼻黏液、唾液、乳汁等分泌液中及肝、肾、淋巴组织中含有此酶。目前，从牛、马等的乳汁中已分离出了溶菌酶，其理化性质与人溶菌酶基本相似，但结构尚不清楚。在植物资源方面，已从木瓜、芜菁、大麦、无花果和卷心菜等植物体中分离出该酶。此种酶对溶壁小球菌活性较鸡蛋清溶菌酶低，但对胶体状甲壳质的分解活性则为鸡蛋清的10倍左右。微生物也能产生溶菌酶，有7个类别：蛋白酶与内肽酶，酰胺酶，N-乙酰己糖胺酶，-1,3、-1,6-葡聚糖酶、甘露糖酶，壳聚糖酶，磷酸甘露糖酶，脱乙酰壳多糖酶。鸡蛋清中的溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，是溶菌酶群中重要研究对象，也是目前了解最清楚的溶菌酶。鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、黄色八迭球菌和巨大芽孢杆菌等革兰氏阳性菌。从其他鸟类如鹤鹊、珍珠鸡、火鸡等的蛋清中分离纯化出溶菌酶，与鸡蛋清之溶菌酶活性非常相似。1.2.人工资源的溶菌酶从蛋清等自然资源提取溶菌酶易受生物材料来源限制，并且由于材料的不统一性，难以保证保鲜度、难以保证不受病毒和其他有害物质污染，产品质量不稳定，已有研究人员利用基因工程重组技术，借助大肠杆菌、酿酒酵母、霉菌等宿主系统，表达人溶菌酶基因，大规模地获得溶菌酶。Yoshimura等通过在人溶菌酶基因上游连接一段鸡溶菌酶信号肽，从而使酿酒酵母工程菌分泌出了有活性的人溶菌酶。钱世均、Shigeru等分别研究了人溶菌酶基因在大肠杆菌、霉菌中的表达，并且都获得了有活性的目的蛋白。2、溶菌酶的理化性质溶菌酶是一种葡萄糖苷酶，其化学性质稳定，干燥条件下在室温可长期保存而活性不丧失。其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。其中鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶，它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子中含有4个二硫键，复发过程相对困难。Phillips等人1965年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构，揭示溶菌酶分子近椭圆形，大小为4.5nm3.0nm3.0nm，其构象复杂，螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的片层结构。研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的，疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用。其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙，为溶菌酶的活性部位。3、溶菌酶的分离纯化溶菌酶传统的分离纯化方法主要有结晶法、离子交换法、超滤法等，在近些年的研究中，也有学者将色谱技术、反胶团萃取技术、膨胀床吸附技术引入到溶菌酶的提取纯化工艺中。（一）传统的分离纯化方法1）结晶法 结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法,通过改变溶液条件,使溶菌酶以结晶态析出。其产率一般为60%80%，操作方法简单,应用于卵清溶菌酶结晶品的工业生产,使产品的成本大大降低,为其医药应用作出了贡献。但是其生产周期较长，产率相对偏低，高纯度产品获取过程复杂，另外此法不能用以分离微量的溶菌酶。2）离子交换法离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术,由于具有简便、高效、成本低,且可自动化连续操作的优点,因此一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法。常用的离子交换剂有Duolite - 464、羧酸纤维素(PC)、羧甲基纤维素(CMC)和羧甲基琼脂糖等。Li Chang等用Duolite-464从性质均一的蛋清溶液中分离溶菌酶,建立的一种简便而有效的工艺过程,可使溶菌酶的回收率高达90-95 %。同时采用Duolite-464分离纯化溶菌酶适合于连续自动化操作。Durance 等也采用Duolite-464从未被稀释的蛋清溶液中同时分离溶菌酶和抗生素蛋白，但得率与酶活都不太理想。陕西科技大学的朱宏新等人采用弱酸性阳离子交换树脂(724 树脂)动态交换洗脱纯化工艺对鸡蛋壳中的溶菌酶进行分离，724 树脂的吸附率达到83.5%。一般的离子交换剂都具有刚性小、收缩性大、再生手续麻烦,且易被柱堵塞的弊端,而李蓉等采用硅胶基质弱阳离子交换剂XIDACEWCX作为填料制作的色谱分离纯化蛋清中的溶菌酶克服了上述的弊端,获得了良好的分离效果,活性回收率为107% ,蛋白的比活为15467 U/mg,纯化倍数提高了5.6 倍。这种方法比传统的软基质离子交换色谱分离法速度快,纯化效率高。Ghosh R采polyvinylidine fluoride(PVDF)膜从蛋清中纯化溶菌酶,此膜通过离子交换机制选择性地结合溶菌酶,它对大量各种各样的有机溶剂、酸等有抑制作用,能通过加热复性而不改变膜的孔度,与其他合成膜比不易阻塞、更耐用。3）超滤超滤技术与传统的生化分离技术相比主要的优点是产品的高产出量,然而尽管超滤技术在反渗析及浓缩等过程中得到广泛的应用,但是它作为在生物工业领域中潜能很大的一种蛋白质分离技术仍然未被得到充分利用。运用超滤技术可以很好地通过调节而获得高产量和高纯度的产品,如果在无菌条件下操作,可以直接生产无菌的溶菌酶溶液, 直接用于临床治疗。Ghosh R 等1999 年报道使用经肌血球素预先处理的50 kDa MWCO聚砜膜的超滤系统分离溶菌酶。利用这种经预先处理过的膜可使溶菌酶的通过量比未经处理的膜提高大约26% ,而其他的蛋清蛋白质的通过量依赖于透膜压( transmembranepressure,TMP)。随着透膜压的升高,通过量下降,因此通过表面预处理和透膜压调节两种方法综合使用,可使溶菌酶全部通过而其他蛋清蛋白质几乎全部截留。在透膜压为20 kPa 时,溶菌酶的纯度为18 %,而在120 kPa时,纯度超过96%。（二）分离纯化方法新进展1）色谱分离技术色谱分离技术有多种类型,其中膜色谱技术是将液相色谱与膜分离结合起来的一种新技术,具有快速、高效、高选择性、易于放大的特点,能满足生物大分子高效分离与纯化的要求,它作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视,广泛地应用于大分子物质的纯化。在膜色谱中，又和亲和、离子交换等技术结合，衍生出亲和膜色谱技术、离子交换膜色谱技术，均有研究者将其应用到溶菌酶的分离纯化中。高速逆流色谱(HSCCC)技术是一种无固体载体的连续液-液分配色谱技术,其固定相通过重力场和离心力作用被包;保留在分离柱内,避免了固体载体与样品发生化学反映而不可逆吸附,样品回收率高,郅文波等人利用多分离柱高速逆流色谱,研究聚乙二醇1000(PEG1000)-磷酸盐双水相体系的固定相保留率及该体系对蛋白质混合物进行分离,以14%PEG1000-16%的磷酸盐体系的上相为固定相,在流速0. 6mol/min和转速900r/min 的条件下,根据细胞色素C、溶菌酶、和血红蛋白三者的分配系数的不同对其进行分离,三者的收率均大于90%。20世纪80年代末出现了亲和色谱技术,以亲和力为基础的生物分离技术是将可逆结合的配基(ligand) 与不溶性的载体(matrix) 偶联,形成具有特异亲和性的分离介质,并用其来选择性的吸附生物活性物质,再通过洗脱来分离所需要的物质。西安交通大学李剑君运用间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法分离纯化了溶菌酶,比较了间歇式吸附和连续式吸附在操作时间上的差异,蛋白质回收率和吸附剂利用率都有所提高。Anca, M. Yakup将染料配基(Blue - 4 和Red-120) 偶联到凝胶上,制备出新型的亲和层析介质,分离纯化溶菌酶。通过对这种新型亲和染料- 配基复合膜对溶菌酶的吸附及动力学特征进行研究,结果表明这种染料- 配基复合膜与普通膜对溶菌酶的吸附能力分别是121.5mg/mL 和8. 3mg/mL ,提高了13.6倍。此外，还有固定金属亲和层析方法、亲和沉淀法、亲和过滤法等以亲和力为基础的分离技术，可应用到溶菌酶的分离纯化中。2）反胶团萃取反胶团萃取是近年发展起来的一种新的萃取方法,它是利用有机溶剂中加入少量表面活性剂形成的反胶团来提取的方法,为一些不能使用有机溶剂萃取的酶和活性蛋白质等生物活性物质开拓了一种新的分离技术,扩大了有机溶剂萃取的适用范围。Sun Y等采用一种亲和染料基质反胶团系统从鸡蛋清粗溶液中纯化溶菌酶,这种反胶团是由辛巴蓝F3GA与改良的大豆卵磷脂在正己烷中反应制得。用粗蛋清溶液进行分离纯化,可使溶菌酶的纯度提高1620 倍,达到0.620.76 mg/ mg 蛋白,这种亲和反胶团系统可以重复使用三次, 加入聚氧乙烯(120) 去水三梨糖醇三油酸酯( Tween85)作为辅助表面活性剂可以提高反胶团系统的容量。在pH9.16的前水相中,使用含有Tween85(20g/L) 的反胶团可以使溶菌酶的产率超过70%。3）膨胀床吸附法膨胀床吸附技术能直接从未经固液分离的生物产品料液中捕集目标产品,集固液分离、吸附纯化为一体,是一个过程集成的操作,可以直接从含有细胞或细胞碎片等固体颗粒的高粘度料液中分离纯化目标产物。膨胀床吸附不仅克服了固定床吸附的缺点,而且缩短处理时间,简化步骤,提高了产品的产量和质量。Tong XD 等报道使用被辛巴蓝3GA修饰的一种定制的NdFeB密实合金琼脂糖凝胶,扩张床吸附系统吸附、纯化溶菌酶的结果与使用CB 修饰的直线型凝胶(CBStreamLine) 相比较,具有更高的纯化倍数。Owen 等报道使用连续逆流、扩张床吸附系统分离溶菌酶,该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题,诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。4、溶菌酶研究和应用展望在环境污染日趋严重的当今世界，在倡导绿色食品的今天，溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保键品和药品。另外，由于人溶菌酶在参与机体的防御机制，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节等方面的作用具有其他来源的溶菌酶无法比拟的优势，具有可观潜在的临床应用价值，因此有关人溶菌酶的应用研究以及如何实现工业化生产已引起广泛的重视。采用当前的基因工程技术，利用原核或真核生物作为寄主细胞，从而为实现大规模生产人溶菌酶提供了可行的途径。这必将把溶菌酶的研究利用推入一个崭新的阶段。参考文献1 刘源岗,邓倩莹,廖问陶 等. 溶菌酶的活性测定.食品科技,2005,10:71-73.2 于滨,迟玉杰. 高活力蛋清溶菌酶制备技术的研究.农产品加工学刊,2006,4:4-6.3 洪潇,余若黔. 溶菌酶的活性测定方法. 生物技术通报,2004,5:40-42.第二部分 实验部分 实验一 层析柱装填及柱效测定一、 实验目的和内容 目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2. 熟悉凝胶层析的一般过程； 3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填； 2. 凝胶柱柱效测定。 3凝胶再生的方法；二、 实验仪器和试剂1. 实验仪器 层析柱（140 cm），砝码天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管，2. 实验材料和试剂 Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、 实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.51 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入34 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/L pH8.0的PBS，以0.51 mL/min流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)， 计算单位高度的柱效 （参考完成时间16：00） 柱效计算公式：N = 5.54r/( W 1/2)2其中，r为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。Sephadex G-100每米理论塔板数为30006000四、 注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。4）所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。五、 演示核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100T档。4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。5、把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在0位 。6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。记录仪光吸收A读数当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:A量程选定在0-2.0档时，数显读数2=实际光吸收读数AA量程选定在0-1.0档肘，数显读数1=实际光吸收读数A部分收集器的操作方法：1. 将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开慢和“定”，再按一下停设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。2定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。六、 实验报告1如实完整地记录实验流程、现象及结果，计算理论塔板数并对其进行深入分析和讨论。2结合理论塔板模型，分析柱效的影响因素，以及如何提高柱效。七、 背景资料凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。图1 凝胶层析的原理凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。（一） 层析柱 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管 , 柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用 20 -30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要 100cm 左右长的层析柱，其直径在 1 -5cm 范围内，小于 1cm 产生管壁效应，大于 5cm 则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 ( 一般制备用凝胶柱，直径大于 2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上 ) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m。 分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 2030cm ，柱高与直径的比较 5:110:1 ，样品溶液体积应小于 凝胶床体积为的 20% 。 分级分离时柱高与直径之线为 20:1100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000 ），样品溶液体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体积可达柱床体积的 20 25 % ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。 （二）凝胶的类型常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下： 种类及主要用途化学组成部分型号颗粒大小（/目数）分离性能（Da）溶胀时间/h20-2590-100葡聚糖凝胶（Sephadex G-）由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成G-10100-200700 31G-15120-2001500 31G-2550-400100-5,000 31G-5050-400500-30,000 31G-75120-4001,000-8,000 243G-100120-4001,000-15,000 723G-150120-4001,000-30000 725G-200120-4001,000-60,000 725聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel p-）由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成P-250-400200-1,800 42P-450-400800-4,000 42P-650-4001,000-6,000 42P-1050-4001,500-20,000 42P-3050-2002,500-40,000 123P-6050-2003,000-60,000 123P-10050-2005,000-100,000 245P-15050-20015,000-150,000 245P-20050-20050,000-20,000 485P-30050-20060,000-400,000 485琼脂糖凝胶（Sepharose gio-gel ）由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成，为中性琼脂糖A 0.5m50-40010,000-500,000 A 1.5m50-40010,000-1,500,000 A 5m50-40010,000-5,000,000 A 15m50-40010,000-15,000,000 A 50m50-400100,000-50,000,000 A 150m50-2001,000,000-150,000,000 （三）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的 2 倍，例如 Sephadex G-200 的吸水量为 20 ， 1 克 Sephadex G200 吸水后形成的凝胶体积约 40mL 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用 100-200 号筛目的的 Sephadex G-200 效果好； 脱盐用 Sephadex G-25 、 G-50 ，用粗粒，短柱，流速快。 （四）凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在 1-2 小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需 24 小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。 （五）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过 Sephadex G-15 短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。 （六）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：(1) 叠氨钠（ NaN 3） 在凝胶层析中只要用 0.02 叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在 20 时约为 40 %。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。(2) 可乐酮 Cl 3C-C(OH)(CH3)2 在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02 % 。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于 60 时易引起分解而失效。(3) 乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为 0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。 苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为 0.001%-0.01 %。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。除了直接加入抑菌剂，在位消毒 （Sanitization-in-place, SIP）和在位清（Cleaning-in-place，CIP）对层析介质和仪器的保养十分重要。SIP的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1M NaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。CIP的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP 时，往往已经包含了SIP，不必再重复。新一代Bioprocess凝胶由于拥有很高的化学稳定性，大都可用至1-2M NaOH在位清洗。BioProcess离子交换、疏水层析介质以40cm/h, 用0.5-2M NaOH相反方向洗四个体积，再以最少3cv平衡缓冲液再生。凝胶过滤介质CIP 的方法相同。但流速需减至20cm/h，接触至少一至二小时。SOURCE介质用二至五个柱体积1M NaCl、1M NaOH、1M HCl、1M NaCl 的顺序以180cm/h 洗柱。每个溶液间需用二个柱体积蒸馏水过柱。去除脂类及疏水性强的蛋白, 使用递增式梯度以410cv 70%乙醇或30%异丙醇洗柱，再用最少3cv蒸馏水加以过柱。或用2cv 0.5% 非离子性去污剂 溶在1M乙酸中 洗柱，再用五个柱体积70% 乙醇过过柱，最后用34cv蒸馏水加以清洗。（六）凝胶回收 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用 70、90、95乙醇脱水平衡至乙醇浓度达 90以上，滤干，再用乙