实验总结-Westernblot.doc

Western BlotWestern Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达WB-蛋白提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（PMSF）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/l浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：1.倒掉培养液，并将培养皿倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液2.每皿细胞加 1ml 4 预冷的 PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3.按 1 ml 裂解液加 10 PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.每皿细胞加 400 l 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养皿要经常来回摇动。5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6.于 4 下 12000rpm 离心 5 min。（提前开离心机预冷）7.将离心后的上清分装转移倒 0.5 ml的离心管中放于-20 保存。二、组织中总蛋白的提取：1.将少量组织块置于 12 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2.加 400 单去污剂裂解液裂（含 PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。3.几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4.裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至 1.5 ml 离心管中，然后在 4 下 12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20 保存。三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1.将培养液倒至 15 ml 离心管中，于 2500rpm 离心 5 min。2.弃上清，加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后 2500rpm 离心 5 min。弃上清后用 PBS 重复洗涤一次。3.用枪洗干上清后，加 100 裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起 4.12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20 保存。（可在蛋白浓度测定结束后用SDS稀释蛋白后再保存）WB-BCA蛋白含量测定一、原理 ： BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂 ，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu 2+ 还原为Cu + ，一个Cu + 螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。二、产品特点：1. 步骤简单，45分钟内完成测定，比经典Lowry法快4倍而且更加方便。2. 灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul 。3. 在50-2000ug/ml浓度范围内有良好的线性关系。4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。三、注意事项：1. 蛋白标准品需在全部溶解后先混匀，再稀释再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。标准品曲线配制时，如果吸量不准确或者加样枪不精确会造成标准曲线相关系数减小，可根据需要使用倍比梯度稀释的方法来配制，或者使用精确度高的加样枪。2. Solution A和Solution B混合成工作液时可能会有浑浊，但充分振荡混匀后就会消失，成为淡绿色的透明溶液。3. 需酶标仪一台，测定波长为540-590nm之间，562nm最佳；需96孔板。如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但是测定蛋白浓度时，需根据测定吸光度的杯子的体积，按比例调整A液，B液和样品的体积。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。4. BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA 低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，-巯基乙醇低于1mM.不适用BCA 法时建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。还可以考虑用超纯水稀释，透析/除盐，ACETONE/TCA沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。5. 为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但是切勿过热。6. 如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，可试用Bradford法蛋白定量四、操作步骤：1 使用时将Solution A摇晃混匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积 Solution B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2 蛋白标准品(0.5mg/ml BSA)：取10ul蛋白标准品(5mg/ml)稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，蛋白标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用去离子水，0.9%NaCl或PBS稀释蛋白标准品。3. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（L） 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（L） 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（g） 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.04. 加适当体积（1l）样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升.5. 各孔加入200L BCA工作液, 37放置30分钟。然后在562nm下酶标仪比色测定。也可以在室温放置2小时，或60放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。6. （BCA550）以蛋白含量（g）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线，根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量及浓度，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度。WBSDS-PAGE 电泳1、 原理：聚丙烯酰氨凝胶（PAGE）电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构，具有分子筛效应。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂巯基乙醇（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。由于十二烷基硫酸根带负电，在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。2、 试剂作用1. 过硫酸铵（APS）为催化剂2. 四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂：APS提供自由基；TEMED催化剂，催化自由基引起的聚合反应。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构3. SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，去蛋白质电荷、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。4. 强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。5. 聚丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；凝胶浓度（%）分子量范围（KB）525-2001010-70155020滤纸PVDF膜）4. 用镊子捏住NC膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水；PVDF膜需用甲醇激活(15s)5. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（气泡易导致短路）6. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。7. 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。8. 在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。9. 如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。10. 转膜结束前配制封闭液及1XTBST缓冲液（10X稀释）。三、步骤：1) 电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备，将转膜夹，切胶板等放在转膜液终浸湿。2) 常用湿转，使用常规1X电转液（现配）。一般配制成10转膜缓冲液储存。需要时配制成1现用。3) 浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在甲醇中浸泡（15s）后转入转移液中平衡，使条带不下弯。将滤纸也浸入转移液中。（在膜的一角切角做标记）4) 取胶：将胶卸下，根据所需蛋白分子量保留一定长度的胶，左上切角（做标记），在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路），夹紧转膜夹后。5) 转膜：湿转：电转槽用双蒸水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将转膜夹封紧后放入电转槽，。要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温，将电泳槽置于冰水混合物中。根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时可垫两块硝纤膜，以免转膜过头。（因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；）对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般 80-100 V，时间也要延长一点。特别是务必注意加强降温措施。（干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。）WB-封闭及杂交封闭：转移后的膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。将膜用 TTBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液（常用脱脂奶粉或5%BSA，磷酸化的蛋白一般首选BSA封闭）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白 marker 则可省略此步。原理：1. 封闭液中的蛋白填塞入膜孔道，封闭膜上疏水结合位点即无蛋白转移区，这样一抗孵育时起到减轻背景作用；2. 封闭液与抗原结合只是非特异性结合膜表面抗原，在一抗孵育情况下大部分可以竞争性的与抗原结合，而此时的一抗和奶粉对杂带的作用均为非特异性的作用， 所以奶粉封闭后可以减少杂带的显色；封闭时间长，条带变弱，此时可以延长漂洗和一抗孵育的时间。免疫杂交原理：1) 印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。2) 处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理。（二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。）处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。3) 目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。步骤:一抗孵育：1) 从封闭液中取出膜，1XTBST5-10minX3次。2) 将一抗用封闭液稀释至适当浓度。3) 将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，4度孵育过夜。4) 次日用1XTBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5-10min。孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18小时）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4度进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。二抗孵育：1. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1h。2. 用1XTBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5-10minWB发光鉴定原理：经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。步骤：1) 将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml）。2) 将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。3) 用胶片夹把膜包起来（期间膜不可以干），放入曝光仪中。4) 根据结果调整曝光时间和曝光强度，得到最佳结果，导出并保存。问题 可能原因 建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全调整装置拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样纹理(纵向条纹)样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样条带两边扩散加样量过多适当减少上样量Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样背景高膜封闭不够延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏高建议 4 结合过夜二抗浓度度过高降低二抗浓度二抗的非特异性背景增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间选择膜的问题硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短洗膜不充分增加洗膜的时间和次数抗体和封闭蛋白有交叉反应检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应杂带较多目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小目的蛋白有其他剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性样品处理过程中目的蛋白发生降解裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行上样量过高，太敏感适当减少上样量一抗不纯纯化抗体一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体二抗的非特异性结合增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）一抗或二抗浓度偏高降低抗体浓度细胞传代较多，导致蛋白变异使用原代或传代少的细胞作对照蛋白条带位置（大小）不对二聚体或多聚体存在增加蛋白质变性过程及强度翻译后剪切比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式相对电荷氨基酸电荷的组成蛋白修饰比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加胶浓度不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差无蛋白条带抗体孵育不充分增加抗体浓度，延长孵育时间酶失活直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因试剂之间不匹配一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性一抗失效选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液HRP 抑制剂所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白二抗与一抗不匹配选择针对一抗来源种属的抗体蛋白条带信号弱抗体孵育不充分增加抗体浓度，延长孵育时间酶活性降低直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物洗膜过度洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20标本中靶蛋白含量太低增加样本上样量抗体活性降低选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置蛋白转移不充分可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流封闭过度减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型曝光时间过短延长曝光时间HRP 抑制剂所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠背景有黑色斑点抗体与封闭试剂反应使用前过滤封闭试剂HRP 偶联二抗中有聚集体过滤二抗试剂，去除聚集体暗背景上白色带HRP 含量过高降低酶联二抗的浓度背景有不均匀的白色斑点转膜过程中有气泡存在仔细检测，避免存在气泡抗体分布不均匀孵育抗体时使用摇床