微生物实验室基本能力和要求ppt课件

食品微生物实验室的基本能力和要求,1,微生物基础知识,微生物的概念 微生物一词并非生物分类学上的专门名词，而是对所有形体微小、单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。微生物类群十分庞杂，其中包括：不具细胞结构的病毒；属于原核生物的立克次氏体和细菌等；属于真核生物的霉菌、酵母菌、藻类和原生动物等；以及属于古菌的产甲烷菌等。,2,微生物是一个通称：形体微小，结构简单的低等生物。 病毒、细菌、放线菌、真菌,种类多、分布广 繁殖快 适应性强 易变异,认识微生物,3,微生物的特点： 分布广、种类多(目前已知的约10万种) 生长旺、繁殖快(大肠杆菌在适宜温度下每20-30分钟繁殖一代) 适应性强 易变异(如对药物的耐受),4,球菌(coccus),脑膜炎奈瑟菌,双球菌(diplococcus),5,链球菌(streptococcus),球菌(coccus),6,球菌(coccus),葡萄球菌(streptococcus),7,球菌(coccus),四联球菌(tetrad),8,球菌(coccus),八叠球菌(sarcina),9,杆菌(bacillus),不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。,10,杆菌的形态多样,杆菌(bacillus),11,杆菌(bacillus),杆菌的形态多样,分枝杆菌,双歧杆菌,12,螺形菌(spiral bacterium),13,微生物在自然界中的分布 土壤 空气 水 人、动植物体,14,微生物与食品的关系,1 作为食品的微生物(食用菌) 2 生产食品的微生物(发酵食品) 3 引起食品腐败的微生物 4引发食物中毒的微生物,15,食品中微生物的污染,食品微生物污染，是指微生物及其产生的毒素通过直接或间接的各种途径进入到食品中，使食品受到污染。,16,食品中微生物污染的危害,美国，每年约有7200万人发生食源性疾病， 造成3500亿美元的损失,2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7， 造成177人死亡，中毒人数超过2万人,1999年，宁夏，沙门氏菌污染肉品，食物中毒暴发， 发病人数上千人,80年代，上海，毛蚶，甲型肝炎爆发，累及30万人,17,18,沙门氏菌（禽、畜肉） 副溶血性弧菌（水产品） 蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭） 肉毒梭菌（发酵制品、肉制品） 单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品） 大肠杆菌O157:H7（肉制品）等。,微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：,19,全国食品中三种致病菌连续监测阳性率变化,20,全国食品中三种致病菌连续监测阳性率变化,21,食品中微生物的污染源,土壤中微生物对食品的污染：与土壤接触过的动、植物性产品等 水中微生物对食品的污染：加工、清洗用水的卫生质量与食品污染有直接关系 空气中的微生物对食品的污染：生产环境的空气质量、尘埃密度与食品污染有关 人及动物体的微生物对食品的污染：,22,微生物污染食品的途径,通过动物体自身携带的病原菌污染：内源性污染 通过水污染 通过空气污染 通过生产加工过程污染 通过运输过程污染 通过贮存过程污染 通过昆虫和媒介动物污染,23,WHO保障安全食物的五个关键,其内容包括: 保持清洁： 生食与熟食分开； 彻底烹调食物; 在安全温度下保存食物； 使用安全的水和安全的原料。,24,食品卫生微生物检验的范围,生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。 原辅料检验：包括动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。 食品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。 食品的检验：重要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。,25,食品微生物检验的指标,食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。,26,食品微生物指标的意义,菌落总数：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。它可以反应食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食品生产的一般卫生状况等。因此它是判断食品卫生质量的重要依据之一,27,菌落(colony)：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。,28,霉菌和酵母,评价食品卫生质量的指示菌,造成腐败变质,pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品,29,食品微生物指标的意义,大肠菌群：包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。这些细菌是寄居于人及动物肠道内的常居菌，它随着粪便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。故以大肠菌群作为粪便污染食品的卫生指标来评价食品的质量，具有广泛的意义。,30,北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。,项目 依据 耐热大肠菌群 NMKL、ISO 粪大肠菌群 NMKL AOAC,定义 在44.5培养，24h内能产酸产气的细菌 在胰蛋白胨肉汤中于44.5，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群 于LST中36培养48h内产气，并于EC内培养4424h产气的一群细菌,31,作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。 通常情况下，耐热大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，耐热大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。,32,食品微生物指标的意义,致病菌：致病菌即能够引起人们发病的细菌。不同的食品根据其受致病菌污染的风险程度，选择一定的菌群进行检验。例如：海产品以致病性弧菌作为检测目标；蛋与蛋制品以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等作为被检菌；米、面类食品以蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、霉菌等作为参考菌群；肉类食品检测单增李氏菌、致病性大肠杆菌等；罐头食品以耐热性芽孢菌作为参考菌群等等。,33,肠道杆菌(enteric bacilli),一大群居住在人和动物肠道中 生物学性状近似的革兰阴性杆菌,属于肠杆菌科,多数是肠道的正常菌群，,至少有30个菌属，120个以上的菌种,少数为致病菌，是胃肠传染病的最重要病原菌,34,在环境和食品卫生学上， 常被用作粪便污染的检测指标,卫生学意义,35,大肠杆菌,(大肠埃希氏菌属 Escherichia coli),是人类和动物肠道中的正常菌群,是国际公认的卫生监测指示菌,出生后数小时就进入肠道，并终生伴随,有些菌型是人或动物的病原菌,36,致病性大肠杆菌引起的腹泻性疾病,37,其中许多为人畜共患病,一大群人与动物肠道中的寄生菌,菌群菌型甚多，仅少数对人致病,沙门氏菌,38,广泛存在于动物 肠道、内脏中,引起中毒的主要是 动物源性食品,39,金黄色葡萄球菌,急性化脓性感染,食物中毒,正常人带菌，30-80%,通过工人手和呼吸道污染食品,40,单增李斯特氏菌,人、畜共患，4生长，冷藏食品,预防措施： 充分烹调产品，对于经过热处理的食品应防止交叉污染。,耐盐，在10%的盐中也可生长,革兰氏阳性短小杆菌,41,形态与染色,涂片中,呈穿梭样,运动非常活泼,液体中,排列整齐,呈鱼群状,革兰染色阴性,弧型或逗点状，,单鞭毛,霍乱弧菌（V.cholerae）,42,生物学特性,嗜盐（halophilic） 在培养基中以含3.5%NaCl生长最为适宜,在“我妻氏琼脂平板”上产生溶血现象,神奈川现象（Kanagawa phenomenon）,副溶血弧菌（V. parahaemolyticus ）,43,其它食品微生物指标,霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起中毒，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青霉属的桔青霉、岛青霉等，镰刀霉属的串珠镰刀霉、禾谷镰刀霉等等。,44,45,其它食品微生物指标,微生物指标还包括病毒，如肝炎病毒、诺沃克病毒，以及人畜共患病病原如：禽流感病毒、口蹄疫病毒、疯牛病病原等。另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫、囊尾蚴、住肉孢子虫、蛔虫、肺吸虫、弓形体、螨、姜片吸虫、中华分枝睾吸虫等等。,46,食品企业常检的微生物项目,微生物计数项目：菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、霉菌、酵母菌计数。 致病菌：沙门氏菌、致病性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核增生李氏菌、金黄色葡萄球菌 其它：商业无菌、抗生素残留,47,食品微生物检验的一般程序,食品微生物检验是一门应用微生物学理论与实验方法的一门科学，是对食品中微生物的存在与否及种类和数量的验证。在生物科学中，微生物学是一门实践性最强的学科之一，它有一套自己独特的研究方法。要做好微生物检验，必须具有坚实的微生物学基础知识，熟悉各种致病菌的生物学特性；掌握各种致病菌、霉菌和病毒的检验程序。,48,微生物检测的一般流程,致病菌检测： 增菌（直接增菌或选择性增菌）-筛选-纯化-生化反应和血清学反应,49,微生物检测室的通用技术要求,微生物检测室必须通过外部和内部控制活动来保证相对稳定的质量。 微生物检验作为一个检测领域，其检验室除了具有实验室的一般要求外，因其自身的特点兼具有特殊的技术要求。,50,一、对人员的要求,有颜色视觉障碍的人员不能执行某些实验 实验室人员应熟悉生物测试安全操作知识和消毒知识 实验人员应具备高中毕业以上文化程度，要不断培训提高检测技术和操作能力,51,微生物学实验的主要内容：,无菌操作技能的培养 无菌概念的建立,无菌操作： 环境：无菌区 人员：无菌概念 物品：严格灭菌,无菌操作的概念,52,人员要求,实验室人员的分类：管理人员、技术人员、技术支持人员等。 相应岗位的人员，应具备相应的技术能力，相应的技术能力证明（证书及证件）。 微生物检验室因有相应技术能力的人负责室内的技术工作。并设立质量监督员。,53,人员的卫生要求(ISO7218),在个人卫生方面，为避免污染样品和培养基，避免个人感染的危险，需要注意下列事项： 穿浅色的、干净的、卫生状况好的实验工作服，这些工作服由布制作，可减少燃烧的危险，这类工作服不能穿出工作区，和衣帽室； 如果必要戴上帽子和口罩以保护头发和胡须； 修好指甲并保持指甲干净，指甲不能留太长； 进行微生物检测前后和去厕所后用自来水彻底洗手，自来水由非手动开关控制；洗手时用液体或粉状肥皂，也可用消毒剂，用适宜的分配容器以一种正确的清洁方式取用。用一次性纸巾或一次性毛巾擦干手； 接种时不能说话、咳嗽等； 在实验区不能吃喝和抽烟； 有感染（甲沟炎）或生病的人员应特别注意，有病部位可能导致细菌污染样品使结果无效； 不要把个人消费的食品放在实验室冰箱里。,54,二、对设施和环境条件的要求,实验室的总体布局和各部位的安排应减少潜在的对样本的污染和对人员的危害。 设施要求以能获得可靠的生物测试结果为重要依据 无菌工作区域应予以明确标识，并能有效地控制、监测和记录,55,布局示例,缓冲走廊,办 公 室,仪 器 室,清 洗 消 毒 室,培 养 基 室,微生物检验室,实 验 台,缓冲室,无菌室,缓冲室,56,ISO7218对实验环境的要求,微生物实验的环境不能影响分析的可靠性。 对场地要求的关注是为了避免交叉污染，应用“单向流动”原则有助于实现该目标。 应对特别环境进行监控，如：超高的温度、粉尘、湿度、蒸汽、噪音、震动、直接暴露在日光下等。 工作区面积应足够大以保持工作区干净、有秩序。为满足所有的测试，推荐每名分析人员使用大约20平米的工作区。 检验过程中，只允许需要进行实验的人员进入测试区。,57,CNAL实验室生物安全认可准则的要求,BSL-2实验室 1) 满足6.1(BSL-1)的要求。 2) 实验室门应带锁并可自动关闭。实验室的门应有可视窗。 3) 应有足够的存储空间摆放物品以方便使用。在实验室工作区域外还应当有供长期使用的存储空间。 4) 在实验室内应使用专门的工作服；应戴乳胶手套。 5) 在实验室的工作区域外应有存放个人衣物的条件。 6) 在实验室所在的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。 7）应在实验室内配备生物安全柜。 8) 应设洗眼设施，必要时应有应急喷淋装置。 9) 应通风，如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。 10) 有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应设备用电源。 11) 实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识。,58,环境设施的相关技术指标,净化室、净化工作区域、洁净环境按国家及部颁标准进行检测。 空气洁净度指标： 检测频率及检测方法。一次/月；空气细菌检测（沉降法）。,59,空气和表面微生物监测 表面污染可直接使用含有营养试剂的表面接触平板评估。空气质量可用含非选择性琼脂培养基(如平板计数琼脂)的培养皿暴露于空气中15分钟的方法检测。 注意别的方法也用于评估表面和空气的污染。,空气监测：3点 5点 室内面积不超过30m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1m；室内面积超过30m2，设东、西、南、北、中5点，周围4点距墙1m。 采样时，将含营养琼脂的平皿（直径9cm）置采样点（约桌面高度），打开平皿盖，使平皿在空气中暴露15min。,60,无菌工作室的监测至少每月一次 监测要有记录 SN0168 规定放置15分钟，每皿15个菌落,61,表面：,工作台：将经灭菌的内径为5cm5cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用一浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。,62,贮存设施或设备应足够保存所有的实验试剂和实验样本，并具备保持其完整性和不会改变其性状的条件 实验室应有妥善处理废弃样品和有害废弃物的设施和制度,63,64,三、 对设备的要求,对影响检测结果的设备应有相应的控制程序 对涉温设备（培养箱、干燥箱、水浴锅、高压灭菌器及冰箱）的温度控制要有日常控制和使用记录 其它实验设备（如天平、蒸馏水器、纯水器、pH计、显微镜及微生物检验、鉴定仪等）也必须有相应的措施保证设备的运行正常和结果的准确。,65,设备应有专人负责并定期维护，有检查和校准的计划 使用的无菌工器具和器皿应能正确实施灭菌措施，并有明显的标识与非无菌工具器和器皿加以区别,66,灭菌设备,67,四、对测量的可追溯性的要求,实验室必须保存有满足实验需要的标准菌种或参照标本。 标准菌种或标本必须从认可的菌种或标本收集途径获得,68,实验室必须以文件化的程序管理菌种和对照标本 管理记录应包括：a.菌种或标本的收集途径和日期。b.保存方式。c.确认记录。d.传代记录。e.培养基及培养、保存条件等。 所有的菌种都要有明确的标识以表明其名称、标准号、接种日期和传代数,69,70,五、对实验用培养基和检测试剂的要求,建立和保持有效的适合试验范围的培养基和检测试剂的质量控制程序 对自备的和商业提供的培养基都需要评估，不得使用不符合要求的试剂、培养基和生物制品,71,对氧气要求：专性需氧菌 微需氧菌 兼性厌氧菌 专性厌氧菌 对CO2要求： 5% CO2,水 碳源 氮源 无机盐 生长因子 有些细菌需要,细菌生长条件,4、对气体要求,3、PH,2、温度,1、营养物质,72,培养基的定义及其分类,培养基： 指人工方法合成的，专供细菌培养、分离、鉴定和保存用的混合营养物制品。,在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基(Media)。 由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。,73,新购入的试剂、培养基和生物制品都要经过适当的验收和登记，必要时要做验证并记录 所有自备的培养基和试剂必须有配制记录和内容明确的标签,74,一般质量检查 生产厂必须提供的文件： 培养基名称、各种成分名称和增补剂名称以及产品编号； 培养基使用前的pH； 储藏条件和有效期； 所有性能评价和所用的测试菌种； 技术数据清单； 质控证书； 必要的安全及危害数据。 实验室检查项目： 培养基的名称和批号； 接收日期； 有效期； 包装的情况和完整性。,培养基的一般质量检查和储藏,75,脱水培养基及其补充剂的质量管理： 脱水培养基一般为粉状物或颗粒状，补充剂一般为胶状或液体； 采取先购先用的原则； 实验室应保存有效的培养基目录清单：容器密闭性复查/首次开封日期/内容物的感官检查（粉末的流动性、均匀性、结块情况和颜色变化等），任何受潮或物理性状发生明显改变的脱水培养基不应再使用。 商品化现成培养基： 应严格按照供应商提供的储存条件、有效期和使用方法进行保存和使用,76,灭菌的培养基和试剂，要有正确的灭菌措施，并有明显的无菌标识,77,六、对检测样品的要求,实验室必须要有文件化的标准抽样程序 抽取的样品必须保证于检验前不发生大的变化，避免污染和微生物含量发生大的变化,78,抽样工具和容器必须无毒无害和清洁无菌，不能影响样品或受样品影响 样品要有内容明确的唯一性标识 要有专门的样品贮藏设备，保证样品性质的完整,79,果蔬制品,肉禽制品,乳制品,谷物制品,水产制品,80,食品企业微生物实验室的基本要求,81,仪器和设施,无菌室或超净工作台(当实验在低污染环境中进行时)：以满足检验量决定,82,微生物常规仪器、设备： a.恒温培养箱:根据检验项目决定数量和类型 b.高压灭菌设备：根据工作量需要选择体积 c.显微镜：普通生物显微镜 d.天平：至少两台 e.蒸馏水器：或纯水器 f.恒温水浴锅： g.电冰箱：有冷冻和冷藏 h.电炉 I.均质器,83,其他设备和辅助设备： a.抗生素残留初筛：离心机、振荡器、均质器、生化培养箱。 b.贝类毒素检测：旋转蒸发器、均质器、离心机、真空泵、水浴锅、小鼠饲养设施,84,方法、标准,1、国标：GB4789.1-4789.312003 2、行标：如：SN0168 0169 等 3、其它国家或国际组织认可的方法和标准：如：FDA、AOAC、ISO、NMKL 4、非标准方法：由实验室经过验证、比对后自已制定的方法。 5、客户要求的方法。,85,标准物质、试剂药品,标准菌株：ATCC(美国标准菌种收藏机构)、CCGMC(中国普通微生物菌种保藏管理中心)、CMCC(医学微生物菌种保藏管理中心)、CICC(工业微生物菌种保藏管理中心)等。 试剂、培养基：有效期内使用、标识清楚。供应商资料完整。,86,操作规范和安全措施,检验人员：要有上岗培训证明，通过比对、盲样考核验证检验员的检测能力 操作规程：全部方法和仪器要建立操作规程，并易于检验员取阅 安全措施：保护人员安全、避免生物学危害、防止交叉污染。,87,实验记录,又称原始记录 记录的内容至少包括： 1，样品的名称和标识 2，检测项目 3，检测采用的方法 4，实验的主要步骤 5，使用的主要培养基、试剂 6，培养的温度及时间 7，实验人员(包括复核人员),88,检测报告,检测结果报告的主要内容： 1，样品的名称和来源以及样品状态的描述 2，检测采用的方法 3，检测的时间及检测完成的时间 4，检测结果 5，报告审核人员签名,89,微生物报告常见形式和意义,菌落总数的报告：以计数结果报告，如： 10 CFU/g(mL) 菌落形成单位CFU(colony forming unit) 大肠菌群的报告：以MPN值 报告，如：30 MPN/100g(mL)、MPN/g(mL)；以定性结果报告，如：阴性/0.01g等 最大可能数MPN( Most Probable Number ) 致病菌的报告：以定性结果报告,如:阴性/g(mL)，阴性/0.1g(mL),阴性/25g(mL),未检出/g(mL)；以MPN值 报告，如金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌检测报告MPN值3/g(mL)。,90,检测质量保证,定期使用有证标准物质和次级标准物质（参考物质）进行内部质量控制。 实验室间的比对或能力验证 利用相同或不同方法进行重复检测 对留存的样品进行在检测。,91,微生物检验质控方法 （一）,菌落计数精密度控制直接计数 选择同一标本，要求检验人员进行菌落计数。 将大肠菌（25922）或经检定标化的菌片，通过合适的梯度稀释，选择合适的稀释度进行菌落计数实验操作。361培养24h进行菌落计数。,92,微生物检验质控方法（二）,菌落计数精密度控制重复计数法 选择十个平板，每个平板具有合适的菌落数（100以内）。将平板编号，由实验人员进行计数并记录结果。去掉平板编号，将平板置冰箱保存过夜，次日取出，重新给予编号，由实验人员重复计数并记录。计算每位实验人员每对结果的平均数（X）。X=（a+b）/2；相对误差（rd）计算：rd=|a+b|/X100%。其它实验人员间的相对误差范围计算：先计算所有实验人员的平均菌落数，X=x/n，要求每一结果均应在X18.2%范围内。,93,重复计数要求,自身同一平皿重复计数误差 小于7.7% 实验人员之间同一平皿重复计数误差 18 .2% 自身同一梯度平行加样两皿间相对误 小于7.7% 实验人员之间同一梯度计数误差X18 .2%范围 不同梯度间菌落计数最终误差 小于7.7%,94,微生物检验质控方法（三）,菌株鉴定质控 菌株鉴定质控要求，对所给的微生物菌株，按有关的方法及指标进行生化、血清等方面的鉴定。 鉴定质量评价：鉴定程序是否正确；鉴定方法是否正确；具体操作技术是否熟练，结果报告是否正确。,95,微生物检验质控方法（四）,盲样测定 是对样品中是否存在目标微生物的定性或定量的分析。对所给的样品，按有关的方法及指标进行一系列的分析，最终给出判断结论。 测定质量评价：选择的方法和程序是否正确有效；具体操作技术是否熟练；结果是否正确。,96,内部质量控制的推荐频率,菌落计数精密度控制： 1次/3月； 菌株鉴定控制： 1次/半年或1年 盲样测定： 1次/半年,97,谢 谢 !,98,