奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建编制说明

内蒙古自治区地方标准奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程编制说明一、 工作简况1. 任务来源：内蒙古自治区市场监督管理局关于下达2019年第2批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知（内市监标准字2019300号）。2. 起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、吉林农业大学、内蒙古大学。3. 起草人：马燕芬、赵磊、吴志红、宋利文、乃门塔娜、凤英、羿静、宝华、张春华、杜瑞平。二、 制定标准的目的和意义随着我国奶牛养殖水平的提高和养殖密度的加大，使得奶牛产奶量也随之递增，同时也加大了奶牛的代谢强度，进而导致机体代谢过程中产生大量的自由基。处于围产期和泌乳高峰期的代谢需要均可增加奶牛体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。正常情况下，动物机体内的氧自由基处于动态平衡，维持机体正常的新陈代谢与免疫功能。但是当ROS生成量超出机体的清除限度，就会引起机体发生脂质过氧化反应，使奶牛处于氧化应激状态，进而改变细胞膜的结构与功能，导致生产性能、炎症应答能力与机体免疫功能下降。此时，机体极易感染上疾病，如乳房炎、胎衣滞留、子宫炎、酮病、真胃变位、脂肪肝等。因此，如何提高动物机体抗氧化能力已成为当前奶牛生产中一个亟待解决的问题。为解决由氧化应激对奶牛机体内部组织、器官及细胞所造成的损伤，需要在体外构建奶牛不同组织细胞的氧化损伤模型，在成功构建乳腺细胞氧化损伤模型的基础上，就可以对其损伤机理进行深入研究。由此可知，构建体外组织氧化损伤模型对深入研究代谢病发病机理的重要性。细胞培养是采用无菌技术从动物机体内分离细胞，然后模拟体内生理环境，使离体细胞体外生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是细胞学研究的基本技术之一，也是细胞生物学乃至整个生命科学研究最基本的试验技术。该技术对现代组织培养技术的发展，尤其对生产大量细胞以适应生物化学分析无疑起到了极大的推进作用。动物乳腺是复管泡状皮肤腺，乳腺细胞的增殖和分化始终贯穿于乳腺发育及泌乳全过程，乳汁中的许多成分只有乳腺上皮细胞才能合成。人们在20世纪70年代就开始对乳腺细胞进行研究，而且在细胞水平上进行了大量的乳腺上皮细胞增殖及分化的研究。近些年，乳腺细胞体外培养的发展在很大程度上由科研需要和畜牧业发展的需求所促成，加速了人们对乳腺的认识和乳腺营养的深入研究。原代培养是从供体获取组织后的首次培养。乳腺上皮细胞是一种贴壁型细胞，在动物机体内，它是以细胞与细胞之间的相互接触、细胞与细胞外基质之间的相互接触的方式生存和生长发育的。体外培养时，此细胞仍然保持这种特性。因此，在分离乳腺细胞时，要尽可能地采用有效的方法获得乳腺上皮细胞。目前主要采用酶消化法或机械法分离乳腺细胞，这样既省时间又可获得大量的目的细胞。原代培养一般需要14周。在这段时间里，乳腺细胞移动活跃，进行贴壁，可见有丝分裂但不旺盛。此时，细胞仍保持着机体内细胞的形态特征和生理功能，相互依存性强，对环境的要求极为苛刻，容易污染。因此在进行原代培养时，首先，要按照一定密度接种，保证在细胞贴壁之前不要剧烈振动。其次，一定要提供充分的营养，减少人员在细胞培养室的走动，尽量避免细菌的感染。做好原代培养是乳腺细胞培养的基础。乳腺细胞氧化损伤模型的构建是在原代细胞培养的基础上通过添加不同作用浓度的氧化剂作用不同时间，通过检测细胞生长情况和氧化指标的情况下来判断所构建的模型是否符合奶牛机体生理状态下氧化应激的发生状态，同时还需判断该模型是否符合我们的试验要求，是否可以继续开展后续的研究。目前奶牛乳腺细胞氧化损伤模型的构建方法很多，所使用的氧化剂也很多，对此也没有制定一个相应的规程。因此，制定奶牛乳腺细胞氧化损伤模型非常必要，在每次开展试验时不需要开展反复试验来验证，直接参考本规程即可。该规程适用于构建奶牛乳腺细胞氧化损伤模型，实验室内新手和熟手都易于操作、操作程序简单。在乳腺细胞培养范围内具有普遍适用性，规程涉及的内容属于自治区经济或社会发展的重点领域。通过该规程的建立，可节省培养时间快速构建，提高试验效率。三、 主要起草过程本标准由内蒙古自治区农牧业科学院动物营养与饲料研究所的科研工作人员，通过构建乳腺上皮细胞模型和构建氧化损伤乳腺上皮细胞模型，查阅国内外相关资料及标准，最终制定出“奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型”。在前期技术资料收集、调研、验证试验和经验总结基础上，标准起草小组按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写编写要求，对标准草案进行编写、修改和完善，于2019年11月完成了标准征求意见稿和编制说明。本标准由内蒙古农牧业科学院提出和申报，内蒙古农牧业科学院作为本标准第一起草单位，吉林农业大学作为主要起草单位，各主要参加单位及工作组成员所做工作见下表：主要参加单位成员主要工作内蒙古自治区农牧业科学院马燕芬负责方案确定，国内外相关技术资料的收集、编制验证试验方案，负责标准起草和说明编写工作吴志红参与方案确定，验证试验等宋利文参与方案确定，验证试验等凤英参与方案确定，验证试验等羿静组织和协调、参与方案确定等工作宝华参与方案确定，验证试验等张春华参与方案确定，验证试验等杜瑞平参与方案确定，验证试验等吉林农业大学赵磊负责国内外相关技术资料的收集、编制验证试验方案，验证试验等内蒙古大学乃门塔娜参与方案确定，验证试验等四、 标准编制原则和依据（一） 标准编制原则本标准格式、结构和编写规则严格按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则的要求进行编写。（二） 主要技术内容确定的依据本标准是基于国家自然科学基金“围产期奶牛乳腺细胞产生氧化损伤的分子机制研究（31460616，2015/1-2018/12）和茶多酚对氧化损伤乳腺细胞的干预作用及机制研究（31601975，2017/1-2019/12）”、内蒙古自然科学基金“氧化应激对围产期奶牛的影响及茶多酚的抗氧化机制研究（2014BS0348，2014/1-2016/12）”和内蒙古农牧业科学院青年创新基金“茶多酚对氧化应激损伤的奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化机制研究（2015QNJJM07，2015/1-2017/12）”；以及2017年内蒙古农业大学硕士论文“茶多酚对氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞的干预作用及机制研究（赵磊，2017）”和“Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤中的作用研究（吴志红，2017）”的研究成果的基础上进行编制的。主要依据以下技术成果：1.H2O2作用浓度和时间对乳腺上皮细胞形态的影响为了筛选出本试验所构建的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型中的H2O2的最佳诱导作用浓度和作用时间，分别在不同浓度和不同时间点检测了H2O2诱导的细胞损伤程度。图1是不同浓度的H2O2作用于奶牛乳腺上皮细胞0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h后，在倒置显微镜下观察到的细胞数量和细胞形态的变化结果。其中横坐标从左到右分别代表0M、100M、200M、400M、600M、800M、1000M，纵坐标从上到下分别代表0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h。从图1结果可以看出，随着H2O2浓度的增加，细胞数量显著降低，作用6h后，600M组的细胞数量明显减少，当作用8h-24h，600M-1000M组的细胞死亡数量过多，不利于后续试验的研究。 0M 100M 200M 400M 600M 800M 1000M图1 倒置显微镜下H2O2对乳腺上皮细胞数量和形态的影响2.H2O2对乳腺上皮细胞增殖率的影响为了确定出H2O2作用浓度和作用时间，本试验测定了H2O2对乳腺上皮细胞增殖率的影响。从表1结果可以看出，随着H2O2浓度的增加，乳腺上皮细胞增殖率在0h24h内呈显著下降趋势。其中在乳腺上皮细胞培养0h4h时，当H2O2浓度为0400M时，增殖率下降缓慢，各组之间差异不显著（P0.05）；当H2O2浓度增加到600M时，乳腺细胞增殖率下降了10%15%，差异显著（P0.05）；当H2O2浓度增加到800M1000M时，细胞增殖率下降达45%，差异显著（P0.05）。在乳腺上皮细胞培养6h8h时，H2O2浓度增加到600M时，乳腺细胞增殖率下降达25%，差异显著（P0.05）；当H2O2浓度增加到800M1000M时，细胞增殖率下降达40%51%，差异显著（P0.05）。在乳腺上皮细胞培养12h24h时，H2O2浓度增加到600M时，乳腺细胞增殖率下降达40%52%，差异显著（P0.05）；当H2O2浓度增加到800M1000M时，乳腺细胞增殖率下降达44%80%，差异显著（P0.05）。随着H2O2培养时间的延长，乳腺上皮细胞增殖率在100mol/L1000mol/L内呈先上升后下降趋势（P0.05）。其中在04h内乳腺上皮细胞增殖率呈上升趋势，在6h时开始下降（P0.05），在6h24h内增值率分别下降了4%37%（P0.05），其中H2O2浓度为600M时，BMECs增殖率下降最为明显（P0.05）。综合以上分析，当H2O2浓度增加到600M时，培养时间为6h8h时，乳腺细胞增殖率下降25%左右，当再增加H2O2浓度和时间，乳腺细胞增殖率下降达44%80%，也有50%的细胞死亡，无法进行后续的试验。因此，为缩短培养时间，本试验选择H2O2作用浓度600M，作用时间6h作为H2O2构建乳腺上皮细胞氧化损伤模型的适宜条件。表 1 H2O2对BMECs增殖率的影响H2O201002004006008001000SEMp-value(mol/L)0h100aA96.97aA96.20aA95.79aA85.28abA56.93cB56.02bB5.2340.0012h100aA97.31aA97.07aA96.57aA87.43aA58.25cB57.09bB4.8520.0014h100aA98.13aA97.89aA97.03aA90.99aA72.48aB69.46aB3.3230.0016h100aA95.76aA88.34bAB86.93bAB78.80bcB65.37bC58.31bC3.3860.0018h100aA94.18aA88.00bAB85.82bAB75.27cB60.00bcC49.46cC4.2580.00112h100aA93.55aA85.63bAB70.09cBC59.24dCD56.01cD38.41dE5.0010.00124h100aAB92.43aA81.92bAB61.13dBC48.67eCD37.42dCD19.81eD8.2670.001SEM02.3052.5931.1832.2622.0771.711p-value0.53810.00040.0010.0010.0010.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异显著（P0.05）。下同。3.H2O2对乳腺上皮细胞培养液中抗氧化指标的影响为了进一步筛选出H2O2作用浓度，本试验测定了H2O2对乳腺上皮细胞培养液中抗氧化指标的影响。结果详见表2和表3。表 2 H2O2作用浓度对BMECs抗氧化指标的影响H2O2SODCATGSTLDHGSH-PX（mol/L）（U/mL）（U/L）（mIU/L）（IU/L）（U/L）0185.01a115.03a911.77c20.57d750.26a100178.49b109.36b917.42c21.68c630.15b200178.12b107.25b921.00c21.83c625.07b400153.55c95.42c1005.02b23.24b620.21b600134.54d88.87d1148.51a25.27a581.73c800134.21d88.55d1154.13a25.41a577.99c1000133.19d88.22d1160.01a25.60a571.27cSEM0.95470.87567.73700.28544.4787P值P-valueP0.0001P0.0001P0.0001P0.0001P0.0001 表 3 H2O2对BMECs ROS、MDA、8-iso-PG、PC和8-OHdG的影响H2O2ROSMDA8-iso-PGPC8-OHdG（mol/L）（pg/mL）（mmol/L）（ng/L）（nmol/mg prot）（ng/L）02926.86d69.83c121.17c0.87d231.63d1003085.17c70.42c122.50c0.91cd234.16cd2003221.02b70.88c125.63b0.97c236.99c4003258.78b73.47b127.29b1.04b249.08b6003551.58a77.30a140.52a1.39a278.08a8003574.08a77.70a141.33a1.41a280.21a10003604.87a78.25a142.05a1.43a282.19aSEM20.34120.41730.82970.02301.6101P值P-valueP0.0001P0.0001P0.0001P0.0001P0.0001由表2结果可知，随着H2O2作用浓度的增加，乳腺上皮细胞培养液中SOD活性和CAT活性显著下降（P0.05）。其中0M为最高，显著高于其他各组（P0.05），且显著高于400M组（P0.05）；600M1000M组为最低，显著低于其它各组（P0.05）。GSH-PX活性随着H2O2浓度的增加呈下降趋势，其中，0M为最高，显著高于其他各组（P0.05）；600M1000M组为最低，显著低于其它各组（P0.05）。GST活性和LDH活性随着H2O2浓度的增加呈上升趋势，其中0M200M组活性为最低，各组之间无显著差异（P0.05）；400M组居中（P0.05）。由表3结果可知，ROS含量、MDA含量、8-iso-PG含量、PC含量和8-OHdG含量随着H2O2浓度的增加呈上升趋势。其中，0M组为最低（P0.05）；100M400M组居中，ROS含量和8-iso-PG含量100M组显著低于200M和400M组（P0.05），MDA含量、PC含量和8-OHdG含量100M组和200M组显著低于400M组（P0.05）；600M1000M组为最高（P0.05）。综合表3和表4的结果可知，乳腺上皮细胞培养液中SOD活性、CAT活性和GSH-PX活性随着H2O2浓度的增加呈显著下降趋势，而GST活性、LDH活性、ROS含量、MDA含量、8-iso-PG含量、PC含量和8-OHdG含量随着H2O2浓度的增加呈显著上升趋势。说明乳腺上皮细胞随着H2O2浓度的增加出现了不同程度的氧化损伤，当H2O2浓度增加到600M1000M时，乳腺细胞氧化损伤程度达到最大，且当H2O2浓度为800M时，乳腺细胞死亡数量显著升高，不利于后续试验的开展。因此，本试验选择600M作为H2O2诱导乳腺上皮细胞构建氧化损伤模型的适宜作用浓度。围产期奶牛由于日粮干物质采食量远远低于机体本身能量需求和泌乳需求，极易导致机体处于能量负平衡状态。一旦奶牛机体处于能量负平衡状态，就会动员机体内产生大量的脂质，多余的脂质就会被氧化并产生大量的ROS，过量的ROS如果不能及时清除就会蓄积于细胞内部，很容易引起奶牛机体产生氧化应激。围产期奶牛由于能量负 平衡以及分娩应激等的影响，极易导致机体产生如乳房炎、酮病、子宫内膜炎、胎衣不下、难产、产后瘫痪等代谢病。近年来的研究显示，氧化应激可使围产期奶牛乳腺组织产生明显的氧化损伤，降低其抗氧化能力，持续的氧化应激通过产生过量的ROS对细胞进行攻击，使其发生脂质过氧化反应，并引起细胞膜结构和功能发生改变。为此，本研究以健康奶牛乳腺上皮细胞为材料，以H2O2为应激源构建氧化应激模型。本试验选择不同浓度的H2O2作用不同时间，通过对乳腺上皮细胞形态、增值率和抗氧化指标的测定，确定出当H2O2作用浓度增加到600M1000M时，作用时间为6h，乳腺上皮细胞氧化损伤程度达到最大，但当H2O2浓度为800M时，乳腺细胞死亡数量显著升高，不利于后续试验的开展。因此，本试验选择作用浓度为600M，作用时间为6h作为H2O2诱导乳腺上皮细胞构建氧化损伤模型的适宜条件。本研究表明：当H2O2作用浓度为600M，作用时间为6h，乳腺上皮细胞产生了明显的氧化应激损伤，但这种损伤不会造成细胞大量死亡，损伤还有可能会被修复，可作为建立乳腺上皮细胞氧化损伤模型时的适宜条件。五、 技术规范的编写说明为了确保起草好本标准，课题组首先确定了本标准中所普及的技术内容不仅具有科学性、先进性，而且更具有实用性和可操作性。本标准是在2017年内蒙古农业大学硕士论文“茶多酚对氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞的干预作用及机制研究”和“Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤中的作用研究”的研究成果的基础上进行编制而成。六、 标准主要内容的说明本标准的主要内容由四个部分组成，即奶牛乳腺样品采集，乳腺样品的初处理和精细化处理，乳腺细胞传代、纯化、冻存和复苏，氧化损伤乳腺上皮细胞模型的构建。本标准规定了乳腺的取样要求，乳腺样品的初处理和精细化处理步骤，乳腺细胞传代、纯化、冻存和复苏，氧化损伤乳腺上皮细胞模型的构建方法。七、 贯彻实施规范的要求及措施本标准在经相关部门批准发布实施后，需要行政部门的监督执行，保证“标准”制定的目的。“标准”在执行的过程中还需要不断的完善和健全。八、参考文献1. 赵磊. 茶多酚对氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞的干预作用及机制研究D. 内蒙古农业大学硕士学位论文，20172. 吴志红. Nrf2-ARE通路在奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤中的作用研究D. 内蒙古农业大学硕士学位论文，20173. 金鹿. 维生素A对奶牛乳腺硒蛋白合成及抗氧化功能影响机理的研究D. 内蒙古农业大学博士学位论文, 20144. Castillo C, Hernandez J, Bravo A, et al. Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy cows J. Vet. J, 2005, 169: 286-292.5. 王艳明. 日粮脂肪和能量水平对奶牛氧化应激、生产性能的影响及抗氧化剂添加效果研究D. 杭州:浙江大学博士学位论文, 20106. 马蕊, 刘仲华, 黄建安, 等. 绿茶和红茶提取物抑制中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化损伤和凋亡的比较J. 湖南农业大学学报（自然科学版），2013,39(4)： 377-381.7. 赵文红，崔慧娴，等. 茶多酚对直链烷基苯磺酸钠致小鼠皮肤损伤的保护作用J.茶叶科学,2016,36（5）：461-468.九、专家修改意见采纳情况序号专家意见采纳情况原因1应增加符号和缩略句。规程中多次出现英文单词和缩写，但未发现有注释。如：3.2中一抗 小鼠源抗Vinculin单克隆抗体。二抗 将小鼠源抗Vinculin单克隆抗体与PBS按1:200比例配制而成。采纳2规程中1和2没有给出具体内容。采纳3术语与定义中格式不规范，另每个定义后是否需要加上英文解释，请统一。采纳4主要试剂配制方法中：每一种试剂前可添加小标题（如4.1基础培养基：DMEM/F12培养基），具体配制方法可以在附录中说明。采纳5文中有多处书写错误。如：6.1.2 乳腺样品的初步处理中：第二行选取1 cm3大小的组织块改为为1 cm3采纳6标准的题目应体现出H2O2诱导氧化损伤，因为还有其他构建BMECs氧化损伤模型的方法。采纳7细胞的冻存和复苏内容建议删去，BMECs传至P3代可以直接用于构建氧化损伤模型。采纳86.1.3的标题建议改为“奶牛乳腺上皮细胞原代培养”；6.1.4的标题建议改为“奶牛乳腺上皮细胞传代和纯化”；7.3的标题建议改为“奶牛乳腺上皮细胞抗氧化指标测定”。采纳93.1饥饿培养的定义需修改完善。采纳107.1 细胞形态观察部分，应描述在倒置显微镜下观察时氧化损伤乳腺上皮细胞的具体数量和形态的变化。采纳117.2.6 测OD值部分，应给出在490 nm处OD值的具体数字或数字范围。 采纳127.3 细胞酶活性测定部分，应明确给出上清液测定氧化和抗氧化指标所测定出的具体数字范围。采纳13封面：内蒙古自治区地方标准；发布单位：内蒙古自治区市场监督管理局前言中本标准技术归口单位为：内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）；正文填加范围内容；术语定义中术语后面要加英文。编制说明中应加立项文号采纳15