新基因功能研究的策略与方法.ppt

新基因功能研究的策略与方法 随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓和生物医学研究在分子水平上的不断深入和推进 越来越多的未知新基因和基因的新功能被发现 越来越多的新基因被得以成功克隆 因此对新基因功能的研究显得日益重要 这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容和首要任务 一 新基因的生物信息学及体内表达规律分析 二 新基因的体内表达规律分析三 功能获得与功能失活策略研究 四 功能失活策略五 基因编码产物相互作用蛋白的研究 基因功能的研究策略主要包括 目前 生物信息学分析已成为新基因功能研究首选和必用方法 其具有方便快捷和经济等优点 研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息 初步推测基因的可能功能 进而制定出进一步的实验室研究方案 1 编码产物预测分析 2 序列同源性分析 3 蛋白质功能域分析 一 新基因的生物信息学及体内表达规律分析 1 mRNA水平的表达谱分析 2 蛋白质水平的表达分析 二 新基因的体内表达规律分析 要开展新基因功能的研究工作 首要的研究任务摸清新基因在体内的表达规律 包括从mRNA和蛋白质两个水平上来对其基因表达谱进行分析 即看其在各种不同的正常或病态组织细胞中是否表达以及表达的水平高低等 新基因在某一特定的正常组织细胞中的表达水平高往往提示其在其中发挥着重要作用 而新基因在相应的病态组织中的表达异常则提示与该病理过程相关的生物学意义 三 功能获得策略 新基因功能研究的功能获得策略即通过将新基因直接导入到某一细胞或个体中 通过观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因的功能 常用的方法有 1 基因转染技术 2 转基因技术 四 功能失活策略 通过观察某一细胞或个体在新基因的功能部分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基因的功能 常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技术和基因敲除等 1 基因沉默技术 2 基因敲除 五 基因编码产物相互作用蛋白的研究 细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物 因此 确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子 也是研究新基因功能的一个十分重要的方面 目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和酵母双杂交系统 1 免疫共沉淀技术 2 酵母双杂交系统 研究者往往最开始得到有价值的EST序列 进而通过电子延伸或和相关实验方法获取其全长cDNA序列 这种情况下 首先要进行即是进行全长cDNA序列的开放阅读框查找 推导其编码蛋白质的氨基酸序列 然后 进行信号肽序列预测分析 初步判定其亚细胞定位 再进行蛋白质的基本理化性质分析 包括氨基酸组成 分子质量 等电点 亲 疏水性等 最后 以已知的氨基酸序列的基础 分析预测其高级结构 编码产物预测分析 规律分析 Cs3亚基蛋白的计算机预测分析 序列同源性分析 包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析 这也是目前生物信息学技术中应用最为广泛的基本技术之一 主要采用BLAST和FASTA程序进行 即从已知的各种核酸和蛋白质序列数据库搜索与新基因对应的功能已知的高度同源基因和蛋白质 从这些已知基因和蛋白质的功能信息中来初步推测和判断新基因的功能 同时 因为人类全基因组测序已经完成 所以以新基因的cDNA序列来对基因组数据库进行同源性比对 则可很方便地获得与其完全同源基因组DNA 序列及其染色体定位信息 而无需进行荧光原位杂交等基因染色体定位技术 进而还可通过分析其内含子 外显子序列及其调节位点 推测其可能的基因表达调控方式 即通过此法确定了富含亮氨酸重复序列蛋白新基因的基因组DNA序列及其染色体定位 用expay软件分析氨基酸序列同源性 主要是通过联网或数据库行蛋白质是基因功能的体现者和施行者 而蛋白质的结构则是蛋白质执行生物学功能的基础 因此对新基因所编码蛋白质的功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价值的信息 目前 已经有大量被发现的蕴藏于蛋白质结构中的与特定生物学活性相关的所谓保守模体 蛋白质功能域分析 蛋白质的结构功能域分析 mRNA水平的表达谱分析 对新基因在mRNA水平上的表达分析涉及到的技术有半定量RT PCR 实时定量RT PCR和NorthernBlot等 半定量RT PCR方法具有简便 快捷和经济的特点 但其存在着精确度不高和不能进行绝对定量等缺点 多用于基因表达水平的快速初步分析 实时定量RT PCR是近年来新发展起来的一种mRNA定量分析技术 因具有特异性更强 有效解决PCR污染和自动化程度高等的特点而被广泛应用 但其成本相对较高 NorthernBlot历来是在mRNA水平上对基因表达进行分析的经典技术 被各实验室广泛采用其不仅可以进行定量分析 而且还能够检测基因转录本的大小及种类 这也是RT PCR技术所不具备的优势但NorthernBlot操作较为繁琐 采用放射性标记时也存在放射性污染的问题 在实际工作中 需结合这两类方法同时进行 互为补充 另外 必要时也应考虑使用原位杂交技术来对新基因的mRNA在特定组织细胞内的分布进行定位观察 蛋白质的水平表达分析 确定新基因在哪些组织细胞被转录后 进一步的工作则是制备相应的抗体来检测其蛋白质终产物的表达情况 如该蛋白质表达的亚细胞定位 分子质量大小 聚体形式等 这种在蛋白质水平上的表达分析涉及到的常用技术主要是WesternBlot和免疫组化等 其中 WesternBlot与NorthernBlot类似 不仅可以进行定量分析 而且还能够检测蛋白质的分子质量大小及其聚体形式 而免疫组化技术的优势则在于其能够确定蛋白质是在特定组织中的哪些细胞以及在特定细胞的哪个部位中表达 Westernblot 另外 对于病态组织细胞而言 在mRNA和蛋白质两个水平上的新基因的表达分析 还可以提供其基因表达调控的大致规律 譬如是主要在转录水平还是在翻译水平上被调控的 不少研究表明 细胞内特定基因的mRNA水平变化和蛋白质水平变化的一致性很差 基因转染技术 通过基因转染 即将目的基因转入某一细胞中通过观察细胞生物学行为的变化来认识基因的功能 是目前应用最多 技术最成熟的基因功能研究方法 如经典的RAS癌基因的功能即通过转染NIH 3T3细胞而得以鉴定目前常用的基转染系统分为非病毒性表达系统和病毒性表达两种 非病毒性表达载体目前主要采用质粒 通过脂质体介导 电穿孔等方法使目的基因被宿主细胞摄取 然而 尽管这类表达系统具有操作简便 经济等优势 其也有不少局限性 主要问题是 不同细胞类型对外源DNA的摄取能力有所不同 尤其在初级未转化的细胞中几乎是无效的 而初级细胞对于观察基因的细胞转化活性等行为恰恰非常有用 然而 病毒性载体 尤其是逆转录病毒载体的使用却能够很好的解决此问题 这类以病毒为载体介导的基因转移因其具有转染效率高 目的基因可稳定表达等优势而被广泛应用 转基因技术 利用转基因技术 则可将外源基因引入动物体内 建立携带并且能够遗传给子代的转基因动物模型 通过对转基因动物的表型分析研究外源基因的功能 目前已经运用转基因技术建立了数千种转基因动物 并且还可以通过在携带外源基因的载体上加上组织特异性启动子等手段 从而控制外源基因在特定的时间或特定的组织器官表达 利用转基因动物来研究基因功能的优势在于它是一个在活体水平上的多维的研究体系 可以从分子到个体水平进行多层次 多方位的研究 基因沉默技术 这类技术中最常用的主要为反义寡核苷酸 ASON 核酶和RNA干扰 RNAi 技术 然而 包括这3种技术在内的该类技术均具有诱导干扰素和其它细胞因子表达等非特异性效应 另外 它们也会因为作用与和靶分子序列相近的分子而产生脱靶效应 其中 ASON因使用剂量大 其非特异性效应最大 而RNAi的这两种副效应最小 基因敲除 或称基因打靶 是建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上的一种方法 既可以在细胞水平上进行 从而建立新的细胞系 也可以在整体水平进行以建立基因敲除动物 通过观察个体的表型变化而推测基因在体内的可能功能 利用基因敲除技术获得的基因敲除动物已成为目前研究基因功能最直接和最有效的方法之一 但因技术条件和费用较高 仅限于小鼠等缺点 且在胚胎期消除了目的基因的功能 可能只反映一部分基因功能 或者某些重要基因被剔除后可导致小鼠在胚胎期凋亡 无法检测对各发育阶段的影响 使基因剔除技术的应用受到限制 同时很多情况下 其结果也是不明朗的 基因敲除小鼠技术 免疫共沉淀技术 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法 该方法的优点是 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的 所处的环境条件也是接近天然状态的 能够反映体内的相互作用情况 也可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 但应该注意 有时免疫共沉淀的蛋白质并非是直接相互作用 如ElA与p107的共沉淀就是间接的相互作用 这实际上是ElA与p107 p107与cyclinA直接相互作用的结果 另外 其灵敏度也相对较低 酵母双杂交系统 是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法 其最大优势在于它可以用已经克隆的基因从特定细胞的2HIE表达文库中 钓取 与其编码产物相互作用的蛋白质及相应基因序列 它检测的相互作用在体内发生 无需额外的纯化步骤 但也存在不少局限性 如突出的 假阳性 问题以及所分析的蛋白质必须定位于核内才能激活报告基因 不利于核外蛋白间相互作用的研究 等 另外 融合蛋白的构建也很可能会影响到蛋白质的正确折叠 另外 近年来已初步建立了哺乳动物双杂交系统 以更好地模拟细胞内环境 探明蛋白质相互作用的机理