资源描述
授课教师 常祖明 学生人数 55 课 题 血液基因组DNA的提取 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学用具 多媒体、实验室设备 教学目的 掌握鸡血DNA提取的原理及方法 教学重点 理解实验过程中每一步操作的目的及原理 教学难点 教学过程一、实验目的1.掌握鸡血DNA提取的原理；2.掌握鸡血DNA提取的方法及操作过程。二、实验原理哺乳动物的成熟红细胞已经高度分化，因而当中没有细胞核，无法提取DNA。禽类的血细胞则可以。禽类代谢旺盛，血液中红细胞更多，而且红细胞中有完整的细胞核、大量的染色体。且材料易得、经济。用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。三、实验仪器1.水浴锅：552.离心机：8000转、12000转3.离心管：5ml（120个）4.移液枪：10l、680l、700l、800l 、900l 、1ml5.容量瓶：100ml6.取血针及管四、实验材料及药品实验材料：普通家鸡：需血液4.08ml（每管136ml）1.无水乙醇作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。理化性质：无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%18.0%（体积）。2.柠檬酸作用：ACD抗凝血剂成分之一。在抗凝剂中，中和柠檬酸钠的碱性。商品信息：分析纯AR，白色塑料瓶/500g，理化性质：无臭，有很强的酸味，白色粉末或颗粒，易溶于水和醇。在潮湿的空气中微有潮解性。储存：在湿空气中有轻微潮解，需阴凉密封干燥保存。危害：柠檬酸浓溶液对黏膜有刺激作用。柠檬酸可燃。粉体与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧爆炸的危险。3.柠檬酸钠作用：ACD抗凝血剂成分之一。能与血液中的钙离子结合成螯合物，而使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固。商品信息：柠檬酸三钠 分析纯500克/瓶。理化性质：有机化合物，外观为白色到无色晶体。无臭, 有清凉咸辣味。常温及空气中稳定, 在湿空气中微有溶解性, 在热空气中产生风化现象。加热至150失去结晶水。易溶于水、可溶于甘油、难溶于醇类及其他有机溶剂，过热分解，在潮湿的环境中微有潮解，在热空气中微有风化，其溶液 pH 值约为8。储存：常温密闭保存危害：无毒4.尿素作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白质变性，尤其能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质。商品信息：化学试剂 分析纯 500克/瓶（塑料瓶装）理化性质：无色柱状结晶或白色结晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，难溶于乙醚，不溶于氯仿。储存：密封避光保存。危害：避免与皮肤和眼睛接触。5.十二烷基硫酸钠(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白质复合体，用于从蛋白质中分离核酸。商品信息：500g/分析纯AR。理化性质：白色或淡黄色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于热水，溶于水，溶于热乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。储存：密封阴凉干燥保存防止受潮受热危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。该品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。6. 1M Tris-HCl(PH8.0)缓冲液 作用：禽血裂解液成分之一。提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液 理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。储存：室温保存。危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。7.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300l，每管10l）作用：消化组蛋白，释放出DNA；消化DNase，提高DNA产量商品信息：（20mg/mL）1ml/支。理化性质：一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌中纯化得到。储存：保存在20冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。危害：使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质。 9.Tris饱和酚 （共需60ml，每管2ml）作用：强蛋白质变性剂。 商品信息：瓶/250ml。理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25%8-羟基喹啉和0.1%的-巯基乙醇。储存：4避光保存。危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。商品信息：瓶/500ml。理化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。储存：保存在密封的棕色瓶中。危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。11.异戊醇作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。商品信息：瓶/500ml。理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。12.无水葡萄糖作用：ACD抗凝血剂成分之一。商品信息：500g/瓶。理化性质：无色结晶或白色结晶性粉末；无臭、味甜。 水中易溶，在乙醇中微溶。储存：无水葡萄糖易吸水结块，因此应密封保存。危害：无。五、实验试剂1. 75%的乙醇 75ml + 25ml水 100ml75%的乙醇2.ACD抗凝剂 100ml（共需48ml，每管0.8ml）柠檬酸0.48g + 柠檬酸钠1.32g + 葡萄糖1.47g 加水至100ml，灭菌后备用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0) 10ml + 0.5M EDTA(PH8.0) 20ml 加水定容至100ml，备用。 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml水80ml + EDTA-2Na 18.61g 用NaOH（约2g）调至PH8.0 定容至100ml 分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-异戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml氯仿 96ml + 异戊醇 4ml = 100ml，4保存5.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1） 共需60ml，每管2ml氯仿-异戊醇（24:1）40ml + Tris饱和酚40ml = 80ml，4保存6. .TE缓冲液 PH8.0 50ml10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml 定容到50ml 高压灭菌后冷却4保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml水 80ml + EDTA-2Na 18.61g 用NaOH（约2g）调至PH8.0 定容至100ml 分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。 【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100l + 水9.9ml 定容至10ml 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液六、实验步骤1.采用翅静脉采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振荡混匀，配成家鸡血样25ml（酒精：血4：1） 目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比无水乙醇效果好，血样不至于太干涩。酒精:血(4:1)混合的血样保存时间长，可达4个月。2.取血样(酒精:血4:1)680mL至5mL离心管中，8000转离心1分钟，弃上清； 目的：去除血样中大部分的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。3.加800mLACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；再加800mLACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清； 目的：ACD抗凝剂可以螯合血液中的钙离子，防治血细胞凝集成团凝固，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。多次离心可以去除血样中的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。4.加1700mL裂解液，10mL蛋白酶K（100mg），摇匀，55水浴保温过夜； 目的：DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来，蛋白酶k还可以消化DNAse，提高DNA产量。55水浴保温过夜可以让蛋白酶K充分发挥作用。5.加2mL饱和酚，摇匀至无块状物，12000转离心10分钟； 目的：饱和酚是强蛋白质变性剂，可以将蛋白质及降解后的产物充分变性，变性后的蛋白质溶解度减低，易沉淀。6.吸取上层透明的DNA溶液至另一5mL离心管中，注意不要搅拌下层的酚蛋白层； 目的：加入饱和酚后溶液分层，上层是透明的DNA溶液，再往下是变性的蛋白质，饱和酚的比重最大在最下层。7.加2mL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），摇匀至悬浮液，12000转离心10分钟； 目的：加入酚-氯仿-异戊醇进一步去除DNA溶液中的残留蛋白质。8.吸取上层DNA液于另一5mL离心管中，加1.8mL氯仿-异戊醇溶液，摇匀，12000转离心10分钟； 目的：由于酚与水有部分混溶，DNA水溶液中会混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-异戊醇在抽提一次可以把酚带走。9.吸取上层DNA液900mL于另一5mL离心管中，加无水乙醇至满，颠倒混合，试管中出现白色团块，即是DNA； 目的：DNA水溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇与DNA不相溶但与水相溶，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用无水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA会部分溶于水中，降低DNA沉淀的产量。10.吸出试管中的无水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重复2次； 目的：像前面步骤中加入的抗凝血剂中的柠檬酸钠、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，经乙醇沉淀后的DNA中会有以上杂质存在。以上杂质有个共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗涤，可以利用其中的15%的水溶解这些杂质除去。11.将DNA自然晾干后溶入1000mL TE缓冲液，-20保存； 目的：乙醇已挥发除去，TE缓冲液一可以抑制Dnase活性，二维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。七、实验注意事项1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作；2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；3.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔；4.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；5.吸出试管中的无水乙醇时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。八、思考题1.本实验中几次用到的不同浓度乙醇的作用是什么？九、实验安排全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。每组作3个离心管，共用一个研钵。每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。
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