《FISH基本原理》PPT课件.ppt

荧光原位杂交技术 原理仪器耗材试剂及配制标本制备探针的制备杂交与检测注意事项 一 原理 将荧光素直接标记的核酸探针 或生物素 地高辛等标记的核酸探针 与标本中的靶核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交 经洗涤后直接 或通过免疫荧光信号扩增 在荧光显微镜下观察 从而对靶目标中的待测核酸进行定性 定位或定量的研究 二 仪器耗材 仪器 荧光显微镜及分析软件 PCR扩增仪 变性 370C隔水培养箱 杂交 湿盒 恒温水浴箱 冰箱 普通离心机 小型高速低温离心机 移液枪 1000ul 200ul 20ul 10ul 玻片盒 通风橱 震荡混匀器 染色缸 计时器 温度计 温湿度显示器 量筒 酒精灯 烧杯 天平 试剂瓶等 二 仪器耗材 耗材 离心管 50ml 15ml 1 5ml PCR管 各种规格的tip头 载玻片 带磨砂的 大盖玻片 方形 用于镜检 小盖玻片 一般用圆形 用于杂交时候封片 封片胶等 三 试剂 液体LB 氯霉素 STE BAC试剂盒 异丙醇 NICK试剂盒 无水乙醇 甲酰胺 20 SSC 2 SSC 70 酒精 90 酒精 100 酒精 BSA HumanCotIDNA 50 硫酸葡聚糖 0 3 NP40 0 4SSC PBS缓冲液 0 1 NP40 2 SSC DAPI染色液等 四 标本制备 按第四章人淋巴细胞培养及收获及染色体制备收获外周血中期染色体 调整悬液浓度 20倍物镜视野下20 30个细胞 分裂指数在4 以上为宜 悬液 200C保存 五 探针的准备 BAC DNA的抽提标记纯化 1 BAC DNA的抽提 无菌操作台上 接种BAC菌种7ul于含氯霉素 氯霉素终浓度为30ug ml 的15ml液体LB培养液中 空气摇床上37 280rpm 震荡培养18 20h 4000rpm 4 离心10min去上清 加入5mlSTE 冰预冷 重悬4000rpm 4 离心10min去上清 加入250ulP1 冰预冷 重悬转入1 5mlEP管中 冰预冷5min 加入250ulP2 预温 轻轻转6次 室温静置5min加入250ulP3 冰预冷 轻轻转6次 冰上5min13200rpm 4 离心10min 1 BAC DNA的抽提 移上清至新的EP管 冰预冷 加入700ul异丙醇 混匀13200rpm 4 离心10min去上清 加入1ml70 无水乙醇混匀13200rpm 4 离心10min去上清 加入15ulNuclease freewater溶解DNA室温放置 2 标记探针 采用缺口平移标记法 NICK试剂盒 在0 5mlEppendorf管中加入 Nuclease freewater13 5uldNTPmix 0 1mM 10uldTTP 0 1mM 5ul10 buffer5ul模板DNA 1 1 5ug 6ulSpectrumGreen或SpectrumOrange或SpectrumReddUTP 0 2mM 2 5ulNicktranslationenzyme8ul总体积50ul 2 标记探针 上PCR仪 15 8小时75 10分钟灭活4 保存取标记后的探针5ul跑1 琼脂糖凝胶电泳检测 标记后探针长度范围在100 400bp较好 稳定 达到5000bp 3 纯化探针 在1 5mlEppendorf管中加入 E colitRNA 1ug ul 1ul鲑鱼精DNA 10mg ml 5ul8M醋酸胺6ul糖元 10mg ml 1ul4 保存 3 纯化探针 将标记好的探针加入上述Eppendorf管 再加入 20 无水乙醇200ul 70 放置30分钟4 15000rpm 离心10分钟去上清 加入200ul70 乙醇4 15000rpm 离心5分钟吸去乙醇 立即加入甲酰胺25ul室温 避光 溶解10分钟 20 保存 六 杂交与检测 外周血玻片准备杂交体系准备杂交洗脱结果观察 1 外周血玻片准备 75 烤箱烘烤2小时置于2 SSC中30min依次放入70 90 100 酒精中各2min室温干燥 2 杂交体系准备 在1 5mlEppendorf管中加入20 SSC1 5ulBSA 1ug ul 1ulHumanCotIDNA 1mg ml 2ul探针3 75ul甲酰胺3 75ul50 硫酸葡聚糖3ul总体积15ul 3 杂交 PCR扩增仪开启 使温度达到80 滴加配好的杂交液15ul于杂交区盖上盖玻片 封胶 PCR扩增仪80 变性2min将玻片置于湿盒 放入37 杂交16小时以上 4 洗脱 杂交次日70 0 4SSC 0 3 NP40漂洗2min室温2 SSC 0 1 NP40漂洗1min室温2 SSC2min室温70 90 100 酒精中脱水各2min室温干燥加20ulDAPI加到杂交区 盖上盖玻片 复染10min荧光显微镜下观察结果 5 结果观察 观察镜下荧光杂交信号 计数30个细胞和采集4张图像 七 注意事项 玻片准备时要注意玻片的干净和透明度 杂交过程中要保持湿润 杂交必须对玻片变性温度进行摸索 染色体制备分裂相应尽量长且分散 胞质应尽量去干净 荧光素和甲酰胺应注意避光保存 甲酰胺有神经性毒性 操作时应注意戴手套 探针溶解应完全 标记模板DNA应尽量纯 没有其他蛋白质及核酸的污染 需要 20 保存的试剂都应分装后 20 保存 谢谢